Использование проточной цитометрии для оценки состояния хроматина в Т-клетках

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол животных был утвержден (номер лицензии: A3242-01) Фурман университет комитет Уходу за животными и использование. Все материалы и оборудование, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице материалов и оборудования, в то время как буферы, используемые могут быть найдены в таблице буферов и решения. 1. Single Cell Подвеска лимфоцитов из селезенок мышей Жертвоприношение мышей с помощью СО 2 удушья. Подтвердите эвтаназии путем смещения шейных позвонков. Примечание: Используйте селезенки из двух 6-8-недельных мышей изогенной (например, C57B / 6) того же пола. Как правило, два селезенки обрабатываются. Спрей животных обильно 70% раствора этанола и сориентироваться таким образом, что голова смотрит влево. Использование щипцов, поднимите кожу животного вверх и от тон тело. С помощью ножниц, вырезать небольшой вырез через кожу около живота животного. Использование пальца, тянуть каждую сторону выемки, чтобы выставить брюшины от шеи до начала задних ног. Селезенка должна быть видна непосредственно под брюшиной. Использование щипцов, поднимите брюшины и сделать небольшой надрез, чтобы выставить селезенки. Удалить селезенки с пинцетом и использовать ножницы, чтобы дразнить от жировой и любой соединительной ткани. Поместите селезенки в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл PBS с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (далее упоминается как PBS + 2%). Держите трубку на льду до готовности, чтобы начать клеточной суспензии. Примечание: Типичный восстановления между 60-90 млн клеток на селезенку, и, как правило, 2 миллиона клеток необходимы в образце. Выполните все следующие шаги в капот культуры ткани. Слейте селезенки в стерильной 100 мм блюдо культуры ткани. Получить два матовых микроскопа и удерживайте тон скользит таким образом, что два грубые матовые поверхности обращены внутрь друг к другу. Намочите слайды в + 2% раствора PBS выливают в чашку Петри. Держите селезенки между матовыми поверхностями в слайды, с краями еще погруженных и растереть селезенки осторожно перемещая слайды и обратно друг против друга (рис 1А). Клетки попадают в чашку Петри. Продолжить шлифовальные, пока все клетки не были освобождены, а остатки селезенки появляются белые (рис 1B). Составление клеточной суспензии в пипетку и фильтровать ее медленно через 70 мкм фильтр в новую стерильную 50 мл коническую пробирку. Следует отметить, что небольшие кусочки красной пульпе будут присутствовать на фильтре (фиг.2А). Если фильтр поднимается вверх, осторожно поднимите его немного, чтобы позволить жидкости стечь и поместите через фильтр обратно в 50 мл коническую трубку и продолжить, повторяя этот процесс по мере необходимости. Если обработки более 5 spleЭНС, это может быть необходимо разделить на две порции и использовать новый фильтр для каждой. Использование стопор часть 3 мл шприц аккуратно нажмите красную мякоть, содержащий оставшиеся клетки через сито (рис 2B). Убедитесь, что нажата как дно фильтра и стороны обеспечить, чтобы все красная пульпа прошла через фильтр (рис 2С). Добавить 10 mlof PBS + 2% к ткани блюдо культуры и использовать это, чтобы мыть слайды, шприц пробку, и блюдо, чтобы восстановить оставшиеся клетки. Передайте это через ситечко же 70 мкм клеток в мл коническую трубку 50. Повторите этот шаг, если необходимо. Центрифуга клеточной суспензии отфильтрованного при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Аккуратно перелить и отбросить супернатант, стараясь не нарушать осадок. Следовые количества PBS + 2% останется в трубке. Закрывают трубку и вылить осадок до тех пор, пока осадок полностью ресуспендировали. Lyse красных кровяных клеток по объявлениемДин 2 мл ACK лизирующего буфера (0,15 М NH 4 Cl, 1 мМ КНСО 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2, хранят при температуре 4 ° С) в селезенке в коническую пробирку и вращать и инвертировать трубку для того, чтобы все клетки вступают в контакт с буфером ACK. Аккуратно вихревой трубки в течение 1 мин при комнатной температуре. Доведите объем клеточной суспензии до 50 мл PBS путем добавления + 2% трубки, чтобы нейтрализовать буфер ACK. Инвертировать трубки 10 раз и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г при 4 ° С. После центрифугирования завершена, осадок должен быть белым (фиг.3). Аккуратно перелить и отбросить супернатант, стараясь не нарушать осадок. Оставить следовые количества PBS + 2% в трубке, крышка трубки, и вылить осадок ресуспендируют его. Добавьте 10 мл Т-клеток средах [10% FBS, 10 мМ HEPES (рН 7,0), 2 мМ GlutaMAX, 1 мМ пирувата натрия, 1 без незаменимых аминокислот, 1x пенициллина / стрептомицина и 50 мМ β-меркаптоэтанол] и, кроме того ресуспендируют осадок осторожнопипетки вверх и вниз. Затем Суспензию фильтруют через новый фильтр 70 мкм в новую 50 мл коническую пробирку. Использование еще 5-10 мл клеточной сред Т для полоскания пробирку и передать это через фильтр 70 мкм в пробирку, содержащую остаток отфильтрованных клеток. Если обработка более двух селезенки, объем клеточных сред Т может быть увеличена до максимального извлечения. Держите клетки на льду до готовый быть окрашены. Клетки должны быть подсчитаны и жизнеспособность обращались. Для подсчета клеток, объединить 3 мл клеток с 24 мл PBS + 2% и 3 мл 0,4% трипанового синего. Нагрузка 10 мл этого в каждой камере с Нейбауэра гемоцитометре. Жизнеспособность, по оценке трипанового синего, как правило, от 85-95%. 2. Жизнеспособность и поверхности Окрашивание Гранул клетки центрифугированием в течение 10 мин при 300 х г при 4 ° С. Ресуспендируют клеток в Т-клеточной среде до концентрации 1 х 10 7 клеток / мл. TransfEr 2 миллиона клеток (100 мл) в лунку U-образным дном для культуры ткани 96-луночного планшета. Центрифуга 96-луночный планшет в течение 10 мин при 300 х г при 4 ° С. Удалить супернатант из каждой лунки, щелкая жидкости в луночного планшета в раковину (клеточный осадок останется в скважине) и вытирать тарелку на чистым бумажным полотенцем. Промыть клетки путем ресуспендирования их в 200 мкл PBS с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Выполните все моет этот путь, если не указано иное. Примечание: Не используйте PBS + 2%, как это будет влиять на фиксируемой PI пятно. Удалить супернатант, щелкая тарелку и добавить 100 мл свежеприготовленного коммерческой пятно (например, поправимо Red Dead пятно клеток) в каждую лунку. Сделать пятно путем разбавления химически активного красителя 1:10 маточного раствора в ДМСО с последующим разбавлением 1:10 в ФБС. Инкубируйте планшет при 4 ° С в течение 30 мин в защищенном от света. Центрифуга рпоздно в течение 10 мин при 300 х г при 4 ° С. В этот момент вперед, выполнять всю работу с пластиной с тканевой культуры капот свет. Удалить супернатант, щелкая пластину, а затем добавить 100 мл раствора блока Fc. Сделайте блок решение Fc путем разбавления Fc блок исходного раствора 1: 100 в PBS. Развести антитела, которые будут использоваться для окрашивания поверхности (например, анти-CD4 или анти-CD8) в PBS и добавляют 100 мл в каждую лунку. Инкубируйте 96-луночного планшета в течение 30 мин при 4 ° С в защищенном от света. Примечание: Поверхностные пятна антитела должны быть оттитрованы для оптимальной производительности. Обычно используют в разведении 1: 400, в соответствии с протоколом производителя: 200 или 1. 3. внутриклеточное окрашивание для гистона H3 После инкубации поверхностного пятна, промыть клетки дважды в PBS. После последней промывки, добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку. Инкубируйте 96-луночного планшета в течение 5 мин при комнатной температуре. Сделайте 4% параформальдегида по dilutING 16% параформальдегида в PBS. Сделать это свежий. Вымойте клетки дважды в PBS. Сделайте решение Пермь / блок (акции Пермь решение PBS + 2% + 0,02% Тритон Х-100, магазин на 4 ° C) путем объединения 2 мл нормальной сыворотки кролика за 100 мл раствора Пермского края. Сделайте достаточно для 60 мл / образец. Добавить 40 мл / Пермь блок для каждого образца хорошо и хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз, осторожно, чтобы не сделать пузыри. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 45 мин в темноте. Сохранить оставшиеся Пермь / блок для шага 3.6. Развести флуоресцентно сопряженную гистонов H3K4me1 антитела в Пермь / Блок решения защищены в шаге 3.5 и добавить 10 мкл этого раствора в каждую лунку. Смешать, осторожно пипеткой вверх и вниз. Инкубируйте 96-луночного планшета в темноте в течение 1 ч при 4 ° С. Примечание: Используйте антитела, конъюгированного H3K4me1 помощью сопряжения комплект R-фикоэритрин в соответствии с инструкциями изготовителя. Вымойте клетки дважды в PBS + 2%. Ресуспендируют клеток в 200мкл PBS + 2% и передать образцы для FACS труб для проточной цитометрии. Образцы можно хранить при температуре 4 ° С в темноте. Для получения оптимальных результатов анализа проб в течение двух дней. По одному окрашенные образцы могут быть использованы в качестве проточной цитометрии управления компенсации.