유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 동물 프로토콜은 퍼먼 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: A3242-01 허가 번호)에 의해 승인되었다. 사용 된 버퍼가 버퍼 및 솔루션의 표에서 확인할 수 있습니다 동안이 프로토콜에 사용되는 모든 재료와 장비, 재료 및 장비의 표에서 확인할 수 있습니다. 마우스 비장에서 림프구 1. 단일 세포 현탁액 CO 2 질식을 통해 마우스를 희생. 자궁 전위에 의해 안락사를 확인합니다. 참고 : 같은 성별의 (예를 들어, / 6 C57B)이 6-8주 된 동종 마우스에서 비장을 사용합니다. 일반적으로, 두 비장 처리됩니다. 풍부 70 % 에탄올 수용액 및 헤드가 왼쪽 직면하도록 동양으로 동물 스프레이. 집게를 사용하여 위쪽으로 멀리 t에서 동물의 피부를 리프트그는 몸. 가위를 사용하여 동물의 복부 주변의 피부를 통해 작은 홈을 잘랐다. 손가락을 이용하여 뒷다리의 시작 목 복막을 노출시키는 절 결부의 양쪽을 당긴다. 비장은 복막 바로 아래에 표시되어야합니다. 집게를 사용하여 복막을 들어 올려 비장을 노출 할 수있는 작은 절개를합니다. 집게와 비장을 제거하고 지방과 결합 조직을 멀리 애타게 가위를 사용합니다. 2 % 태아 소 혈청으로 보충 된 10 ml의 PBS를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 비장을 배치 (이하 PBS + 2 % 이상으로 함). 단일 세포 현탁액을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. 참고 : 일반적인 복구 비장 당 60-90000000 사이의 세포이며, 일반적으로, 2 백만 세포 샘플 당이 필요하다. 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행한다. 멸균 100mm 조직 배양 접시에 비장을 가만히 따르다. T 두 프로스트 현미경 슬라이드를 얻어 개최두 거친 프로스트 표면이 서로를 향해 안쪽으로 마주 보도록 그는 슬라이드. PBS + 2 % 용액에 슬라이드를 습윤 페트리 접시에 붓고. 여전히 침수 가장자리에, 슬라이드의 프로스트 표면 사이의 비장을 잡고 서로 (그림 1A)에 대해 앞뒤로 슬라이드를 움직여 부드럽게 비장 갈기. 세포는 배양 접시에 빠질 것입니다. 모든 셀이 출시과 비장의 유물 (그림 1B) 흰색 표시 될 때까지 연마를 계속합니다. 피펫으로 세포 현탁액을 그려 새로운 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 필터를 통해 천천히 필터링합니다. 빨간 펄프의 작은 조각이 필터 (그림 2A)에 존재할 수 있습니다. 필터가 상승하면, 부드럽게 필요에 따라이 과정을 반복, 유체를 통해 드레인과 50 ML 원뿔 관에 다시 필터를 배치하고 계속 할 수 있도록 약간 들어 올려. 5 개 이상이면 처리 spleENS, 두 개의 배치에 나누어 각각 새로운 필터를 사용하는 것이 필요할 수있다. 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부를 사용하여 부드럽게 스트레이너 (도 2b)를 통해 나머지 세포를 포함하는 적색 펄프를 누른다. 모든 빨간 펄프 필터 (그림 2C)를 통과 한 것을 확인하기 위해 필터 바닥과 측면을 모두 눌러해야합니다. 조직 배양 접시에 10 mL의 PBS + 2 %를 추가하고 남아있는 세포를 복구하기 위해 슬라이드, 주사기 스토퍼, 그리고 요리를 세척 할 때 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 같은 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 이 단계가 필요한만큼 반복합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기. 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. PBS + 2 %의 미량이 튜브에 남아있을 것이다. 튜브 캡과 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 펠릿을 가볍게. 광고로를 Lyse 적혈구ACK 용해 버퍼의 딩 2 용액 (0.15 M NH 4 CL, 1 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, 4 ° C에서 7.2, 저장소의 pH) 원뿔 튜브에 비장 당 회전 보장하기 위해 튜브를 반전 모든 세포 ACK 버퍼와 접촉. 부드럽게 실온에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이 친다. PBS + 2 % ACK 버퍼 중화 튜브를 첨가하여 50 ml의 세포 현탁액의 양을 준비한다. 4 ℃에서 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고 10 시간을 전환. 원심 분리가 완료되면, 펠렛을 백색 (도 3)이어야한다. 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. 튜브에 PBS + 2 %의 미량 남기기 튜브를 캡핑하고, 재현 탁을 위해 펠릿을 가볍게. T 세포 배지 [10 % FBS, 10 mM의 HEPES (PH 7.0), 2 mM의 루타, 1 mM 나트륨 피루 베이트, 1X 비 필수 아미노산, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 또한 10 ㎖를 추가 부드럽게하여 펠릿을 재현 탁로 pipetting 아래. 그런 다음 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 새로운 70 μm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링 할 수 있습니다. 원래 튜브 헹구고 여과 셀의 나머지 부분을 포함하는 튜브에 70 μm의 필터를 통해 통과하는 T 세포의 다른 매체를 사용하여 5 ~ 10 mL로. 두 개 이상의 비장을 처리하면, T 세포 배지의 부피는 회복을 최대화하도록 증가 될 수있다. 준비가 염색 할 때까지 얼음에 세포를 유지합니다. 세포 계산과 생존에 액세스 할 수 있어야합니다. 세포를 계산하려면 24 PBS + 2 % ㎖의 3 ㎖ 0.4 % 트리 판 블루로 세포의 3 ㎖을 결합한다. 로드 향상 노이 바 우어의 혈구의 각 챔버에이 10 ㎖. 트리 판 블루 배제에 의해 평가로 생존은 85-95% 사이에 일반적입니다. 2. 생존과 표면의 얼룩 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 1 × 107 세포 / ml의 농도로 T 세포 배지에서 세포를 재현 탁. TRANSFU 바닥 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 200 만 ER 셀 (100 ㎖). 4 ° C에서 300 XG에서 10 분 동안 96 웰 플레이트를 원심 분리기. 잘 싱크대에 웰 플레이트에서 액체를 쓸어 넘겨 각각의 상층 액을 분리합니다 (세포 펠렛은 잘 유지됩니다) 깨끗한 종이 타월에있는 플레이트에 뿌리며 마치. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하여이를 세포 씻어 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리 하였다. 별도의 표시가없는 한, 모든 세척이 방법을 수행합니다. 참고 :이 고칠 PI 얼룩 방해로 PBS + 2 %를 사용하지 마십시오. 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 각 웰에 새로 제조 된 상업 얼룩 (예를 들어, 고칠 붉은 죽은 세포 얼룩) 100 ㎖를 추가합니다. PBS에서 1:10 희석 한 다음 DMSO의 반응성 염료 원액의 1:10 희석하여 얼룩을 확인합니다. 빛으로부터 보호 30 분 동안 4 ° C에서 접시를 품어. P를 원심 분리기후반 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안. 이 시점에서, 오프 조직 문화 후드 라이트와 함께 접시에 모든 작업을 수행합니다. 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 다음의 Fc 블록 용액 100 ㎖를 추가합니다. 된 Fc 블록 원액 1 희석 된 Fc 블록 솔루션을 확인하십시오 : PBS에서 100. 희석 된 항체를 PBS에 대해 표면의 오염 (예를 들어, 항 CD4 또는 CD8 항)를 사용하고, 각 웰에 100 ㎖를 추가한다. 빛으로부터 보호 4 ℃에서 30 분 동안 96 웰 플레이트를 품어. 참고 : 표면 얼룩 항체가 최적의 성능을 위해 역가해야합니다. 제조업체의 프로토콜 당 400 희석 : 200 또는 1 : 일반적으로 1을 사용합니다. 히스톤 H3 3. 세포 내 염색 표면 얼룩의 부화 후, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 마지막 세척 후, 각 웰에 4 % 파라 포름 알데히드 100 μl를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 96 웰 플레이트를 배양한다. dilut 4 % 파라 포름 알데히드를 확인PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드를 보내고. 이 신선합니다. PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 파마 / 차단 솔루션을 확인 (주 파마 솔루션은 PBS + 인 2 % + 0.02 % 트리톤 X-100, 저장 4 ° C에서) 100 ㎖ 주식 파마 액 당 정상 토끼 혈청 2 ㎖를 결합하여. 60 ㎖ / 샘플에 대한 충분합니다. 부드럽게 거품을 만드는 않도록주의하면서, 아래로 피펫 팅에 의해 잘 잘 각 샘플에 40 ml의 파마 / 블록을 추가하고 혼합한다. 어둠 속에서 45 분 동안 실온에서 접시를 품어. 단계 3.6 파마 / 벽돌 남은 저장합니다. 단계 3.5에 예약 파마 / 차단 솔루션에 형광 접합 히스톤 H3K4me1 항체를 희석하고 각 웰에이 희석의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 섞는다. 4 ℃에서 1 시간 동안 어둠 속에서 96 웰 플레이트를 품어. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 R-피코 에리 트린의 결합 키트를 사용하여 결합 H3K4me1 항체를 사용합니다. 두 번 PBS + 2 %의 세포를 씻으십시오. (200)에서 세포를 재현 탁PBS + 2 % μL 및 유동 세포 계측법 분석을위한 외과 튜브에 샘플을 전송합니다. 샘플은 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최적의 결과 두 가지 일 이내에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 단독 스테인드 샘플 보상 유세포 컨트롤로서 사용될 수있다.