T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

この研究は、米国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って行きました。動物プロトコルはファーマン大学施設内動物管理使用委員会（：A3242-01許可番号）によって承認されました。使用される緩衝液は、緩衝液および溶液の表に記載されていますしながら、このプロトコルで使用されるすべての材料および機器は、材料および装置の表に記載されています。 マウス脾臓からのリンパ球の1単一細胞懸濁液 CO 2窒息を経由してマウスを生け贄に捧げます。頸椎脱臼により安楽死を確認してください。 注：同じ性別の（ 例えば、C57B / 6）は、2つの6〜8週齢の同質遺伝子のマウスから脾臓を使用してください。典型的には、2つの脾臓を処理します。 やたら70％エタノール溶液とヘッドが左を向いているような配向で動物をスプレー。 ピンセットを使用して、上方に離れトンから動物の皮膚を持ち上げます彼は体。はさみを使用して、動物の腹部近くの皮膚を通して小さなノッチを切りました。指を使用して、後ろ足の先頭に首から腹膜を露出するようにノッチの各側面を引き出します。脾臓は、腹膜のすぐ下に表示されるはずです。 鉗子を使用して、腹膜を持ち上げ、脾臓を露出させるために小さな切開を行います。ピンセットで脾臓を削除し、任意の脂肪および結合組織を離れていじめるためにハサミを使用しています。 2％ウシ胎児血清を補った10 mlのPBSを含む50 mlのコニカルチューブに脾臓を配置（以下、PBS + 2％程度と呼ばれます）。単一細胞懸濁液を開始する準備ができるまでチューブを氷上に保管してください。 注意：一般的な回復が脾臓100万60〜90の間の細胞であり、典型的には2万個の細胞は、サンプルごとに必要とされています。組織培養フード内で、以下の手順のすべてを実行します。 無菌の100mm組織培養皿に脾臓をデカント。 T 2つや消し顕微鏡スライドを入手し、保持します2粗いつや消し面が互いに向かって内側に向くように彼がスライドします。 PBS + 2％溶液中にスライドを湿潤ペトリ皿に注ぎました。 エッジはまだ沈んで、スライドのつや消しの表面の間に脾臓を持ち、（ 図1A）互いに対して前後にスライドを移動することで静かに脾臓を挽きます。細胞をペトリ皿に分類されます。すべてのセルがリリースされていると脾臓の遺跡が（ 図1B）、白表示されるまで研削を続けます。 ピペットで細胞懸濁液を描画し、新しい滅菌50mlコニカルチューブに70μmのフィルターを通してゆっくりそれをフィルタリングします。赤い果肉の小片がフィルタ（ 図2A）上に存在することになることに注意してください。 フィルタが上昇する場合は、ゆっくり、必要に応じてこのプロセスを繰り返し、流体が通過排出し、50mlのコニカルチューブに戻すフィルタを配置し続けることができるように少し持ち上げます。以上5 spleを処理する場合ENSは、それが二つのバッチに分割し、それぞれのための新しいフィルタを使用する必要があるかもしれません。 3ミリリットルシリンジのストッパ部を使用して静かにストレーナ（ 図2B）を介して、残りの細胞を含む赤い果肉を押してください。すべての赤い果肉がフィルタ（ 図2C）を通過したことを確認するために、フィルタ底と側面の両方を押してください。 組織培養皿をPBS + 2％mlof 10を追加して、スライドを洗浄し、シリンジストッパー、これを使用し、残りの細胞を回収するために皿。 50 mLコニカルチューブに同じ70μmのセルストレーナーを介してこれを渡します。必要に応じてこの手順を繰り返します。 4℃で5分間、300×gで濾過した細胞懸濁液を遠心。 静かにペレットを乱さないように気をつけ、上清を除去し、廃棄します。 PBS + 2％の微量チューブに残されます。チューブに蓋をし、ペレットを完全に再懸濁されるまで、ペレットをはじきます。 広告によって溶解赤血球円錐管に脾臓あたりの鼎のACK溶解緩衝液2 mLを（0.15 M NH 4 Clで、1 mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA、7.2にpHを、4℃で保存）し、回転していることをすべてのセルを確実にするためにチューブを反転ACK緩衝液と接触します。穏やかに室温で1分間チューブを旋回。 PBS + 2％ACK緩衝液を中和するためにチューブを追加することにより、50 mlの細胞懸濁液の量をもたらします。 4℃で300×gで5分間チューブを10回、遠心分離を反転。遠心分離が完了した後、ペレットは、白（ 図3）である必要があります。 静かにペレットを乱さないように気をつけ、上清を除去し、廃棄します。チューブにキャップを、チューブにPBS + 2％の微量のままにして、それを再懸濁したペレットをはじきます。 【FBS、10mMのHEPES（pH7.0）に、2mMのグルタ、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、および50mMのβメルカプトエタノール10％] T細胞培地の10 mLを加え、さらに優しくによってペレットを再懸濁上下にピペッティング。次に、新しい50mlコニカルチューブに新しい70ミクロンのフィルターを通してサスペンションをフィルタリングします。 元のチューブを洗浄し、濾過した細胞の残りの部分を含むチューブに70μmのフィルターを通してこれを渡すために、T細胞培地の別の5〜10ミリリットルを使用してください。二つ以上の脾臓を処理した場合、T細胞培地の容積は、回収を最大にすることができます。 準備が染色されるまで細胞を氷上に保管してください。細胞を計数し、生存率がアクセスする必要があります。 細胞をカウントし、0.4％トリパンブルーのPBSの24ミリリットル+ 2％と3mlで細胞の3ミリリットルを兼ね備えています。改善されたノイバウアーの血球計数器の各チャンバーにロードし、この10mlのを。生存率は、トリパンブルー排除によって評価されるように、85から95パーセントの間であるのが典型的です。 2.生存率および表面染色 4℃で300×gで10分間遠心分離して細胞をペレット化。 1×10 7細胞/ mlの濃度になるようにT細胞培地中で細胞を再懸濁。 TRANSFU底96ウェル組織培養プレートのウェルに、ER 2百万細胞（100ml）で。 4℃で300×gで遠心分離に10分間、96ウェルプレート。 （細胞ペレットを十分に残ります）流しにウェルプレート内の液体をフリックし、清潔なペーパータオル上でプレートを軽くたたくことにより、各ウェルから上清を取り除きます。 200μlのPBS中にそれらを再懸濁することにより細胞を洗浄し、4℃で10分間、300×gで遠心分離しました。特に断りのない限り、すべての洗浄をこのように実行します。 注：それは修正可能PI染色を妨害するようPBS + 2％を使用しないでください。 プレートをフリックすることにより上清を除去し、各ウェルに新たに調製した商業染色（ 例えば 、固定可能な赤の死細胞染色）の100ミリリットルを追加します。 PBS中で1:10希釈に続いてDMSO中の反応染料原液を1:10に希釈することによって染色を行います。光から保護して4℃で30分間プレートをインキュベートします。 Pを遠心後半4℃で300×gで10分間。この時点で、組織培養フードライトをオフにして、プレートにすべての作業を行います。 プレートをフリックすることにより上清を除去し、FCブロック溶液100mlを加えます。 PBS中100：Fcのブロック原液1に希釈したFcブロック・ソリューションを作成します。 PBSで表面染色（ 例えば、抗 CD4または抗CD8）に使用される抗体を希釈し、各ウェルに100 mlで加えます。光から保護して4℃で30分間、96ウェルプレートをインキュベート。 注意：表面染色抗体は、最適なパフォーマンスのために力価を測定する必要があります。製造業者のプロトコルごとに、400倍希釈200または1：一般的に1を使用しています。 ヒストンH3 3.細胞内染色表面染色のインキュベーションの後、PBSで2回細胞を洗浄します。 最後の洗浄後、各ウェルに4％パラホルムアルデヒドの100μlを添加します。 RTで5分間、96ウェルプレートをインキュベートします。 dilutで4％パラホルムアルデヒドを作りますPBS中16％のパラホルムアルデヒドをる。これは新鮮なことを確認します。 PBSで2回細胞を洗浄。 100 mlのストックパーマ液あたりの正常ウサギ血清の2ミリリットルを組み合わせることにより、（株パーマ液をPBSで+ 0.02％トリトンX-100 + 2％、4℃で保存）パーマ/ブロック・ソリューションを作成します。 60ミリリットル/サンプルのために十分なことを確認します。 各サンプルウェルに40ミリリットルパーマ/ブロックを加え、穏やかに気泡をしないように注意しながら、上下にピペッティングによりよく混ぜます。暗所で室温で45分間、プレートをインキュベートします。ステップ3.6のためのパーマ/ブロックを残り保存します。 ステップ3.5で予約パーマ/ブロック溶液中に蛍光共役ヒストンH3K4me1抗体を希釈し、各ウェルにこの希釈液の10μlを添加します。静かにピペッティングにより混和します。 4°Cで1時間、暗所で96ウェルプレートをインキュベートします。 注：製造者の指示に従ってR-フィコエリトリン結合キットを使用して、コンジュゲートしH3K4me1抗体を使用してください。 PBS + 2％で細胞を2回洗浄します。 200で細胞を再懸濁PBS + 2％μlで、フローサイトメトリー分析のためにFACSチューブに試料を移します。試料は暗所で4℃で保存することができます。最適な結果を得るために2日以内に試料を分析。単独で染色されたサンプルは、フローサイトメトリー補正コントロールとして使用することができます。