流式细胞仪用来评估染色质的T细胞国家

这项研究进行了严格按照指南中的美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用的建议。动物方案得到批准弗曼大学机构动物护理和使用委员会（许可证号：A3242-01）。所有材料在这个协议中使用的设备能材料和设备的表中找到，而使用的缓冲器可缓冲和解决方案的表中找到。 1.单细胞悬液的淋巴细胞从小鼠脾脏通过二氧化碳窒息牺牲老鼠。确认安乐死颈椎脱位。 注意：使用脾脏从同一性别两个6-8周龄同基因小鼠（例如，C57B / 6）。通常情况下，二脾脏被处理。 喷动物大汗，用70％的乙醇溶液和定向，使得头朝左。 使用镊子，提起动物的皮肤向上和远离吨他的身体。使用剪刀，通过附近的动物的腹部皮肤切开一个小切口。用手指，拉出槽口的每一侧，以从颈部腹膜暴露于后​​腿的开头。脾应可见直接腹膜下方。 使用镊子，提起腹膜，并做一个小切口，显露脾。用钳子取出脾并用剪刀戏弄离开任何脂肪和结缔组织。 将脾脏到50毫升锥形管中含有10毫升的PBS补充有2％胎牛血清（以下简称为PBS + 2％）。保持管在冰上直至准备开始单细胞悬浮液。 注意：典型的恢复是每脾之间60-90百万个细胞，并且通常，需要2百万细胞，每个样品。执行所有以下步骤在组织培养罩。 滗脾脏进入无菌100mm组织培养皿。 获得两个磨砂显微镜载玻片和保持牛逼他滑动，使得两个粗糙磨砂表面面对向内朝向彼此。湿润PBS + 2％的溶液中的幻灯片倒入培养皿。 保持幻灯片的磨砂表面之间的脾，与仍然淹没的边缘，并通过移动来回滑动相互对抗（ 图1A）轻轻研磨脾脏。这些细胞会落入培养皿。继续打磨，直到所有的细胞已被释放，脾的遗骸出现白色（ 图1B）。 绘制出的细胞悬浮液在吸管，并通过70微米的过滤器过滤它慢慢倒入一个新的无菌50ml锥形管中。需要注意的是小件红髓将存在于过滤器（图2A）。 如果过滤器上升，轻轻将其提起略微以允许流体排出，通过与将过滤器放回50ml锥形管中并继续，根据需要重复这个过程。如果在处理超过5 spleENS，可能有必要分成两批，并使用一个新的过滤器的每个。 用3毫升注射器的止动部轻轻按压穿过滤网（ 图2B）含有剩余细胞红髓。一定要按下两个过滤器底部和侧面，以确保所有的红髓已通过过滤器（图2C）通过。 添加10 mlof PBS + 2％的组织培养皿中，并用它来洗幻灯片，注射器限位装置，菜以回收剩余的细胞。通过相同的70微米的细胞过滤到50毫升锥形管传递此。这个步骤需要重复。 离心过滤的细胞悬浮液在300×g离心5分钟，在4℃。 轻轻倒出并弃去上清液，注意不要打扰颗粒。的PBS + 2％一丝金额将留在管。帽管和轻弹沉淀，直到沉淀完全重悬。 裂解红细胞按广告丁2毫升的ACK裂解缓冲液（0.15M的氯化铵 ，1mM的KHCO 3，0.1mM的EDTA，pH为7.2，保存于4℃）每脾到锥形管并旋转和反转管，以确保所有的细胞接触到该ACK缓冲器接触。轻轻旋转管在室温1分钟。 通过加入PBS + 2％管以中和该ACK缓冲器使细胞悬浮液的体积至50ml。倒置该管的10倍，离心5分钟，在300×g离心在4℃下。离心完成后，将沉淀应该是白色的（图3）。 轻轻倒出并弃去上清液，注意不要打扰颗粒。离开的PBS + 2％的微量在管，帽管，并轻弹颗粒重悬了。 加入10 mL的T细胞培养基[10％FBS的10mM HEPES（pH 7.0）中，2毫含有GlutaMAX，1mM丙酮酸钠，1×非必需氨基酸，1×青霉素/链霉素和50mMβ巯基乙醇〕，和进一步的轻轻悬浮颗粒上下吹打。然后通过一个新的70微米的过滤器过滤该悬浮液到一个新的50ml锥形管中。 使用另一个5-10毫升的T细胞培养基冲洗原管，并通过70微米的过滤器通过该入含有过滤细胞的其余部分的管。如果在处理两个以上的脾脏，T细胞培养基的体积可增加到最大限度回收。 保持细胞在冰上，直到准备染色。细胞应该算和可行性进行访问。 计数细胞，结合3 ml的细胞用24毫升的PBS + 2％和3 ml的0.4％台盼蓝。负载10毫升到这一种改进的Neubauer血细胞计数器的每个腔室。可行性的评估，台盼蓝染色，通常为85-95％。 2.活力和表面染色沉淀细胞，在300×g离心离心10分钟，在4℃。重悬的细胞在T细胞培养基至1×10 7个细胞/ ml的浓度。 TRANSF器2百万细胞（100毫升）中成U形底96孔组织培养板的孔中。 离心96孔板10分钟，300×g离心在4℃下。 井由孔板进水槽内轻弹除去液体从每个上清液（细胞沉淀将保留在孔）并在干净的纸巾涂抹在板。通过再悬浮他们在200μl的PBS洗涤细胞，然后离心以300×g离心在4℃下10分钟。除非另有说明执行所有洗涤这种方式。 注：请不要使用PBS + 2％，因为它会与定像PI染色干扰。 通过轻弹板除去上清液，加入100毫升新制备的商用染色剂（ 例如 ，可固定红死细胞染色）的各孔。 通过稀释在DMSO活性染料原液1点10分，随后用1:10稀释在PBS使污渍。孵育板在4℃下避光30分钟。 离心在p迟在300×g离心10分钟，在4℃。在这一点上前进，执行与该板与组织文化引擎盖光了所有的工作。 通过轻弹平板去除上清，再加入100毫升的Fc块解决方案。制作的Fc封闭液稀释的Fc块原液1：在PBS 100。 要使用的稀释抗体表面染色（例如，抗CD4或抗CD8）在PBS中，加入100 ml的每个孔中。孵育96孔板30分钟，在4℃下避光。 注意：表面染色的抗体应滴定以获得最佳性能。通常使用1：200和1：400稀释，根据制造商的协议。 3.细胞内染色的组蛋白H3 以下表面染色温育后，在PBS中洗细胞两次。 最后一次洗涤后，加入100μl的4％多聚甲醛的每个孔中。孵育96孔板5分钟，在RT。使4％多聚甲醛通过dilut荷兰国际集团在PBS 16％多聚甲醛。使这个新鲜的。 在PBS洗涤细胞两次。 使彼尔姆/砌块溶液（股票彼尔姆溶液是PBS + 2％+ 0.02％的Triton X-100，保存于4℃）用正常兔血清的每100毫升的库存彼尔姆溶液将2ml。做足够的60毫升/样本。 添加40毫升永久/块到每个样品孔拌匀轻轻吹打向上和向下，注意不要让泡沫。孵育板在室温在黑暗中45分钟。保存剩余的烫发/块步3.6。 稀荧光缀合的组蛋白H3K4me1抗体在步骤3.5保留彼尔姆/砌块溶液，并添加10微升该稀释的每个孔中。轻轻吹打向上和向下混合。孵育96孔板在黑暗中进行1小时，在4℃。 注意：使用的H3K4me1抗体使用R-藻红蛋白缀合试剂盒按照制造商的说明，缀合。 两次在PBS + 2％洗细胞。 悬浮细胞在200μLPBS + 2％和转移样本，以FACS管用于流式细胞术分析。样品可以储存在4℃下在黑暗中。为了达到最佳效果分析样品在两天之内。单独使用染色的样品可以用作流式细胞补偿控制。