Simultanée à deux photons<em> In Vivo</em> Imagerie d'entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
La microscopie à deux photons a révolutionné l'observation de l'activité cérébrale dans la vie et de se comporter animaux. Depuis son introduction en 1990 , il a rapidement gagné en popularité et est maintenant mis en œuvre comme l' une des approches les plus intéressantes et novatrices en vue de l' examen de nombreux aspects de l' activité cérébrale in vivo 1,2. Ces applications comprennent des mesures du flux sanguin, l' activation des neurones (par exemple, en utilisant des indicateurs de niveau de calcium ou des gènes précoces immédiats expression) et la morphologie des cellules neuronales. Un nombre croissant de laboratoires utilisent des microscopes à deux photons, la mise en œuvre de la technique à travers le monde scientifique comme une nouvelle norme pour l'imagerie in vivo du cerveau.
L'approche standard consiste à l' implantation de la fenêtre crânienne (un trou rond dans le crâne recouvert d'un couvercle en verre) sur le canon ou le cortex visuel du cerveau de la souris 3. Ensuite, selon le protocole expérimental, le MOUSE subit une série de visualisation et des séances de formation de comportement, ce qui permet de suivre l'évolution de l'activité du cerveau et de la morphologie neuronale au cours du temps 4,5. Dans les deux cas, la craniotomie affecte uniquement l'os pariétal, sans traverser les sutures. Il est notoire que le principal inconvénient de cette technique est limitée à son application cortexes facilement accessible tel que le canon ou le cortex visuel. Implantation de la fenêtre crânienne par rapport aux autres régions pose beaucoup de difficultés, en raison de saignements excessifs et / ou entrave spatiale.
Dans cet article , nous proposons l'implantation de la fenêtre crânienne au- dessus du cortex rétrosplénial (RSC) comme une autre région d'intérêt possible pour les deux photons en microscopie in vivo 6. RSC est un élément important du circuit responsable de la formation de la mémoire spatiale du cerveau. Anatomiquement, RSC est une partie d'un réseau neuronal de connexion corticale, hippocampique et régions thalamiques 7. C'estfortement impliqué dans une gamme de comportements, tels que l' apprentissage spatial et de l' extinction, ainsi que la navigation spatiale 6.
Afin de visualiser les changements morphologiques des neurones , nous utilisons une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de Thy1. Chez ces souris, la GFP est exprimée dans environ 10% des neurones dans le cerveau permettant une visualisation claire des axones et des dendrites corticaux utilisant microscopie à deux photons 8. Une autre innovation que nous proposons est l'injection d'un virus adéno-associé recombinant de sérotype 01/02 (rAAV2 / 1) codant pour une protéine fluorescente rouge (mCherry) sous une CaMKII promoteur spécifique des neurones 9 dans les structures plus profondes du cerveau faisant saillie vers le RSC telles que l'hippocampe. L'expression de rAAV2 / 1 mCherry dans l'hippocampe de souris Thy1-GFP permet la visualisation simultanée des éléments de pré- et post – synaptiques de la hippocampo-cortical synapses 10. L'expression rAAV mécanique de mCherry nécessite deux à trois semaines pour la protéine d'atteindre un niveau suffisant dans les terminaisons axonales. Cette période est conforme à l'heure habituelle nécessaire pour la récupération de craniotomie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le présent document , nous présentons un protocole pour l'utilisation simultanée de deux photons dans l' imagerie in vivo des entrées synaptiques et des cibles postsynaptiques dans RSC à travers une fenêtre crânienne. La procédure d'implantation se composent de plusieurs étapes clés. Tout d'abord, l'animal est profondément anesthésié et fixé dans le cadre stéréotaxique, puis le crâne sur le RSC est amincie avec un foret le long des lignes circulaires marquées …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier M. Steczkowski pour les enregistrements vocaux, M. Borczyk pour les dessins, A. Trąbczyńska pour la production de virus, M. Ziókowska pour le génotypage et A. Mirgos de l'aide pour le tournage. KR reconnaît le genre don du virus recombinant adéno-associé (rAAV) exprimant la protéine fluorescente mCherry sous le contrôle du promoteur de CaMK de K. Deisseroth. Ce projet a été réalisé dans les installations de base de laboratoire de modèles animaux et de laboratoire de la structure des tissus et de la fonction, Centre de neurobiologie, Nencki Institut de biologie expérimentale, avec l'utilisation de l'infrastructure CePT financé par l'Union européenne – le Fonds européen de développement régional au sein le programme opérationnel «économie innovatrice» pour la période 2007-2013. Ce travail a été soutenu par des subventions du Centre national des sciences: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 à KR et Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
Riferimenti
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
