Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Esosomi sono piccole vescicole di dimensioni variabili da 30 nm a 100 nm che vengono rilasciati sia costitutivamente e dopo stimolazione da una varietà di tipi di cellule. Si trovano in una serie di fluidi biologici e sono noti per portare una varietà di proteine, lipidi e molecole di acido nucleico. Originariamente pensato per essere poco più di serbatoi di detriti cellulari, i ruoli di esosomi che regolano processi biologici e nelle malattie sono sempre più apprezzati.
Diversi metodi sono stati descritti per isolare exosomes di terreni di coltura cellulare e fluidi biologici. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità, ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l'isolamento exosome. Tuttavia, il plasma di HIV-1 individui infetti contiene sia esosomi e particelle virali HIV, che sono simili per dimensioni e densità. Così, la separazione efficiente di esosomi da particelle virali HIV nel plasma umano è statouna sfida.
Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato una procedura modificata da Cantin et. al., 2008 per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano. Iodixanolo gradienti di velocità sono stati usati per separare esosomi da HIV-1 particelle nel plasma di HIV-1 individui positivi. Particelle virali sono stati identificati mediante p24 ELISA. Esosomi sono stati individuati sulla base dei marcatori exosome acetilcolinesterasi (AChE), e gli antigeni CD9, CD63, CD45 e. La nostra procedura gradiente prodotto preparativi exosome gratuitamente particelle virali. La purificazione efficiente di esosomi da plasma umano ci ha permesso di esaminare il contenuto di exosomes derivati dal plasma e di indagare il loro potenziale di modulazione immunitaria e altre funzioni biologiche.
Introduction
L'HIV-1 epidemia continua ad avere un impatto significativo in tutto il mondo. A partire dal 2013, circa 35 milioni di persone in tutto il mondo vivevano con l'HIV, e 2,1 milioni di questi erano individui contagiati 1. Le strategie di prevenzione e un maggiore accesso alla terapia antiretrovirale sono stati utili nel ridurre l'acquisizione complessiva di HIV. Tuttavia, singole popolazioni stanno ancora sperimentando aumenti per l'acquisizione di HIV-1. Quindi, vi è la necessità di proseguire gli sforzi per affrontare questa epidemia.
Uno dei più forti predittori di progressione della malattia da HIV è attivazione immunitaria cronica (CIA) 2-10. Definito da persistentemente elevati livelli di citochine rilevabili e marcatori di espressione elevati sulla superficie dei linfociti T, CIA è stato attribuito a: i) continua la produzione di cellule dendritiche di tipo I IFN 11; (ii) l'attivazione immunitaria diretta guidata da proteine dell'HIV Tat, Nef e gp120 12; (iii) Traslocazione di proteine batteriche intestinali associate a cellule immunitarie 6. Tuttavia, il meccanismo esatto (s) cronica sottostante, l'attivazione immunitaria sistemica nell'infezione da HIV devono ancora essere completamente chiariti.
Il nostro gruppo di ricerca e altri hanno dimostrato un ruolo di esosomi HIV patogenesi 15-18. Il nostro gruppo ha stabilito che la proteina Nef è escreto dalle cellule infette in esosomi 15, e exosomal Nef (exNef) è presente nel plasma di individui affetti da HIV a livelli nanogrammi 18. Abbiamo dimostrato che astante CD4 + T-cellule esposte a exNef provocato attivazione indotta morte cellulare dipendente dal percorso CXCR4 19, 20. In alternativa, monociti / macrofagi erano refrattari all'apoptosi exNef indotta, ma esposto funzioni cellulari alterati e di espressione di citochine. Esosomi Più di recente, il nostro gruppo ha dimostrato isolate dal plasma di individui affetti da HIV contengono una varietà di citochine pro-infiammatorie. Further, ingenui cellule mononucleate del sangue periferico esposti a exosomes plasmaderivati da pazienti con infezione da HIV indotta espressione di CD38 sulle cellule memoria ingenuo e centrale CD4 + e CD8 + T. Ciò probabilmente contribuisce ad infiammazione sistemica e la propagazione virale tramite l'attivazione delle cellule astante 21, e suggerisce che esosomi giocano un ruolo importante nella patogenesi dell'HIV.
Nel indagare il ruolo di esosomi nella patogenesi dell'HIV, una sfida sta sviluppando tecniche per esosomi efficacemente separati da particelle di HIV, pur mantenendo il contenuto exosomal così come la loro capacità funzionale modulazione immunitaria. Diversi metodi sono stati descritti per isolare esosomi da coltura cellulare e fluidi biologici 22,23. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità (esosomi galleggiare con una densità di 1,15 – 1,19 g / ml), ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l'isolamento exosome 23.Tuttavia, con infezione da HIV supernatanti di coltura cellulare e nel plasma dei pazienti contengono sia esosomi e HIV-1 particelle virali. Esosomi e HIV-1 particelle sono molto simili per dimensioni e densità. In alternativa, sfruttando l'espressione di marcatori exosomal unici come CD63, CD45, CD81 e, esosomi sono stati isolati con metodi di cattura immunoaffinità 23. Questa procedura può separare il virus da esosomi. Tuttavia, l'inconveniente di questa tecnica è la stretta attaccamento di anticorpi purificati esosomi, che potrebbero interferire con la valutazione del potenziale immunomodulante di esosomi in coltura.
Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una procedura per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano modificati rispetto Cantin e collaboratori 22 utilizzando iodixanolo gradienti di velocità. Esosomi sono stati trovati a segregare in bassa densità / frazioni superiori di gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali separati nel altadensità / frazioni inferiori. Particelle virali sono stati identificati da p24 ELISA e esosomi sono stati identificati utilizzando marcatori exosome AChE, CD9, CD63, CD45 e. Le frazioni a bassa densità superiori raccolti contenevano esosomi che erano negativi per la contaminazione da HIV-1 p24. La purificazione efficiente e la separazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano permette di accurato esame del contenuto di esosomi derivati dal plasma umano e l'indagine del loro potenziale modulatore immunitario e il valore diagnostico e prognostico di esosomi in HIV-1 patogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attivazione cronica del sistema immunitario (CIA) e l'esaurimento delle cellule T CD4 + sono due importanti caratteristiche di HIV-1. Essi sono stati istituiti come predittori di patogenesi, con CIA essere il miglior predittore. Tuttavia, i meccanismi alla base di guida attivazione immunitaria cronica sistemica e il declino delle cellule CD4 + T ancora non sono stati completamente chiariti. Noi e altri laboratori hanno sviluppato prove certe che esosomi secreti da HIV-1 le cellule infettate giocano un ruolo in entra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
Riferimenti
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