Stamcelachtige<em> Xenopus</em> Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em> In Vitro</em> En<em> In Vivo</em

Het gewervelde zenuwstelsel Uit de neurale plaat als een homogene laag van neuro-epitheelcellen. Begrijpen hoe ontwikkelingsprogramma's worden geïnduceerd, gecodeerd, en vastgesteld tijdens regionalisering van de neurale plaat is, op dit moment, een belangrijke doelstelling in de ontwikkelingsbiologie. In vergelijking met andere systemen, de experimenteel vatbaar Xenopus embryo is een model van keuze voor het analyseren van vroege stappen van neurale ontwikkeling ^1,2. Het is gemakkelijk om grote aantallen embryo's te verkrijgen en buitenlandse ontwikkeling geeft toegang tot de eerste stappen van neurulatie ^3. Veel tools beschikbaar om experimenteel te manipuleren Xenopus laevis (X. laevis) embryonale ontwikkeling. Micro-injectie van mRNA of morfolino (MO), waaronder induceerbare MO, samen met biochemische en farmacologische gereedschappen, maakt gecontroleerde gain of function (GOF) en functieverlies (LOF) en de specifieke wijziging van signaaltransductiewegen ^4,5. De blastocoel dak ectoderm, rond de animale pool van een blastula of een zeer vroeg gastrula embryo en aangeduid als het "Animal Cap (AC), een bron van pluripotente cellen die kunnen worden geprogrammeerd door manipulatie van genexpressie vóór explantaten bereiding. In dit manuscript zijn gedetailleerde protocollen te gebruiken X. laevis AC explantaten testen in vitro en in vivo moleculaire mechanismen en cellulaire mechanismen van neurale ontwikkeling.

Een techniek wordt gepresenteerd, waardoor fijne observatie van genexpressie patronen in een Xenopus kikkervisje neurale buis, een eerste stap in de identificatie van het lot bepalen cues. Overwegende dat de waarneming van de flat-gemonteerde weefsels vaak wordt gebruikt in de studie van kippenembryo's ^6, het is niet goed beschreven in Xenopus. Manipulatie van genexpressie door het injecteren van synthetisch mRNA of MO in de blastomeren van 2 of 4 cellig stadium embryo maakt programmering van ACexplantaten ^4. Bijvoorbeeld remming van Bone Morphogenetic Protein (BMP) route door expressie van het anti-BMP factor Noggin, geeft een neuraal identiteit AC cellen ^3. Het protocol wordt gedetailleerd beschreven voor het uitvoeren van lokale en tijd gecontroleerde blootstelling van AC explantaten om extrinsieke signalen via direct contact met een anionenuitwisselingshars kraal. Tenslotte wordt een techniek beschreven voor het testen ontwikkelings kenmerken van neurale voorlopercellen in vivo transplantatie van gemengde explantaten bereid uit verschillende geprogrammeerde cellen gedissocieerd en opnieuw verbonden.

De kikker embryo is een krachtig model voor de vroege gewervelde neurale ontwikkeling te bestuderen. Het combineren van manipulatie van genexpressie in vitro culturen explanteren levert belangrijke informatie bij de studie van neuroepithelium regionalisering, proliferatie en morfogenese ^7-12. De programmering van AC explantaten toegelaten ontwikkeling van een functionele hart ex vivo ^13,14. Het gebruikvan explantaat enten ¹⁵ geleid tot de identificatie van de minimale transcriptionele switch induceren van de neurale differentiatie programma ^16. De zona limitans intrathalamica (ZLI) is een signalering centrum dat sonic hedgehog (Shh) om de groei en regionalisering van de caudale voorhersenen controle afscheidt. Bij voortdurende blootstelling aan Shh, neuro-cellen co-expressie van de drie transcriptiefactor genen – Barh-achtige homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) en Iroquois-3 (irx3) – verwerven van twee kenmerken van de ZLI compartiment: de bevoegdheid om uitdrukken shh, en de mogelijkheid om te scheiden van de voorste neurale plaat cellen. Als modelsysteem, zal de inductie van een ZLI lot in neuro-epitheelcellen gepresenteerd ^8.

Deze protocollen zijn gericht op het leveren van eenvoudige, goedkope en efficiënte hulpmiddelen voor ontwikkelingsstoornissen biologen en andere onderzoekers om de fundamentele mec verkennenhanisms van belangrijke neurale cel gedrag. Deze protocollen zijn zeer veelzijdig en laat het onderzoek van een groot aantal extrinsieke en intrinsieke neurale vastberadenheid cues. Het staat op lange termijn in vivo analyse van de neurale lineage inzet, inductieve interacties en cel gedrag.