세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

1. 세포 외 유출 악기에 버퍼링 전력을 측정 : 두 개의 변주 참고 : 계산 및 여기서 설명하는 방법은 세포 외 유출 분석기를 사용하여 개발되었다. 다른 악기를 들어, 측정 량을 적절히 스케일링되어야한다. 제조업체의 지침에 따라 (재료 및 장비를 참조) 염산 농축액을 사용하여 물에 0.1 M 표준 염산을 준비합니다. 주 : 모든 네 주입구에 사용 염산 주사를 준비하기위한 예시적인 계산은 표 1에 도시된다 : 표 아니라 세포 외 플럭스 분석에 1. 연속 염산 주사. 매체에 염산 표준 희석액을 제조는 카 인 기술의 복제 수는 표 1에서와 같이 분석 될한 판에서 IED, 더하기 하나는 피펫 오류 수 있도록, 예를 들어, 포트의 네 가지 기술 복제 주입 (48.9 μL × 5) 분석 매체 (1.1 μL × 5) 0.1 M 염산의 재고를 준비합니다. 측정 프로브 카트리지의 각 포트에 50 μl를 배포합니다. 나머지 포트 B, C 및 D에 대해이 절차를 반복 네 개의 포트 가산의 각 [2 분간 혼합, 1 분간 대기 한 5 분의 측정]의 2 사이클이어서 표준 교정 사이클 외 플럭스 분석 (10), 실행 (도 2 참조). 소프트웨어 명령어에 따라 구 소프트웨어에서 상기 실험 프로그램. 기계로 제조 된 카트리지를로드하고 소프트웨어 지침에 따라 보정을 수행합니다. 프로그램에 연결되면, calibrant 함유 플레이트를 제거하고 잘 악기로 각각 분석 매체를 포함하는 플레이트를 삽입; 프로그램을 계속. 유 앞에서 정상 상태에서 얻어 8-10 데이터 포인트 (전형적으로 80-10 마지막 점)의 평균과 각각의 포트 부를 첨가 한 후, 각각의 표준 산 주입으로 인한 산도 (ΔpH)에서 (누적)의 차이를 계산한다. nmol의 H에 대해 플롯 ΔpH + 측정 탐침 (7)에 의해 포획 μL 부피 함유 하였다. 선형 기울기는 MPH / pmol의 H 종 +에서 버퍼링 전원 (BP)입니다. 대안 단계 1.2~1.3로, 표 2와 포트 D.에서 HCl을 주입 하였다 포트가, B, 및 C는 실험을 행할 때 사용되는 분석 다음 ΔpH 측정을 수행하는 네 개의 기술적 복제는 세포 외 플럭스 분석 플레이트의 (4 배경 온도 보정 웰은 제외) 20 실험 웰에 5 점 표준 곡선의 각 점을 생성하는 데 사용된다. 53464table2.jpg "/> 잘 세포 외 플럭스 분석에 표 2. 단일 염산 주입입니다. 2. 외부의 pH 측정기를 사용하여 버퍼링 전력을 측정 주 : 외부의 pH 프로브를 사용하여 매체의 완충력을 측정 37 ℃에서 탐침을 보정하고 모든 시약 실험 동안이 온도를 유지한다. 제조업체의 지침에 따라 염산 농축액을 사용하여 물에 0.1 M 표준 염산을 준비합니다. 따뜻한의 pH 탐침, 기준 산도, 그 버퍼링 전력 측정하는 분석 배지, 수욕에서 37 ℃로 0.1 M 염산. 제조업체의 지침에 따라 37 ℃에서의 pH 프로브를 보정합니다. 열판이나 수조를 사용하여 분석에 걸쳐 37 ℃에서 모든 시약을 유지한다. 분취 작은 비커 또는 원추형 튜브에 분석 배지 10 ㎖. 지속적 몰입의 pH 프로브를 사용하여 pH를 모니터링합니다. 같은 0.1 M 염산 추가10 ~ 20 μL 분취 중간을 말한다. 교반 막대를 사용하거나 수동으로 각각의 산 부가 한 후 컨테이너를 소용돌이로 혼합해야합니다. pH 측정을 안정화시키기 위해 몇 초, 각 첨가 후 pH를 기록 할 수 있습니다. 표 3에서 증명 된 바와 같이, 추가의 충분한 수의 정확한 기울기 계산을 보장하고 실험 기간 동안 예상되는 pH 범위를 커버 할 수 있도록. 표 3. pH 미터를 이용하여 버퍼링은 전력을 측정. 데이터는 0.1 M HCl을 여섯 20 μL를 추가 전형적인 실험을 나타낸다. 을 nmol의 시간 +에 대한 플롯 ΔpH 버퍼링 전력 (그림 1)을 나타내는 직선의 기울기를주고, 7 μL 당 덧붙였다. <p class="jove_content" fo:keep-together부근에 자리 잡고 페이지 = "항상"> 도 1 버퍼링 파워를 결정. 염산 표준 곡선은 표 3과 표 1, 표 2 (여기)와 같이 측정 하였다. 선형 피팅 곡선의 기울기는 완충력 (PH / nmol의 H +의 7 μL에서)를 제공한다. 각 점은 N의 ± SEM = 9 기술 복제를 의미 나타냅니다. 완충력이 방법 1 또는 상기 (2)를 통해 알려지면, 전력을 버퍼링하여 ECAR 나누어 PPR (pmol의의 H + / 분 / μg의 단백질)에 ECAR 신호 (MPH / 분)로 변환 (BP) (MPH / pmol의 H 종 +) 각 웰의 단백질 함량에 스케일링 : PPR의 TOT (pmol의의 H + / 분 / μg의 단백질) = ECAR (MPH / 분) / BP (MPH / pmol의의 H + 7 μL에서) 잘 (μg의) 당 / 단백질 식 (6) 대안 적 방법에서 동일한 실험을 사용S (1) 또는 (2)가 자동으로 데이터를 수집하는 동안 PPR를 계산하는 장비 소프트웨어가 사용하는 완충 능 (BC) 값을 산출한다. 참고 :이 장비는 사용자 설명서 12 (107 페이지)을 계산하고 BC는 다음과 같이 설명되어 완충 능력을 사용하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공합니다 BC (몰 / L) = 몰의 H + / (ΔpH X 버퍼 용량 (L)) 식 (7) 주 : 수학 식 7에 정의 된 버퍼링 용량은 상기 외부 기기의 pH 프로브 분석에서 계산 될 수있다. 완충 능력과 완충 능력 사이의 변환을 쉽게 (첨부 된 스프레드 시트를 참조) 수행 : BC = 1 × 10-9 / BP ((MPH / pmol의의 H + 7 μL에서) / 7 μL) 식 (8) 주 : 상기 분석을 수행하기에 앞서 공지 된 경우, 완충 능력이 실험 중에 설치 장비 소프트웨어에 직접 입력 할 수있다. 이전 발행 6에 기술 된 바와 같이,이 절차 대부분의 기존의 버퍼 시스템 위에서 사용 된 계산을 적용합니다. 참고 : 표 4는 완충 능력과 여러 기존 미디어의 완충 능력. 표 4. 버퍼링 전력과 선택한 미디어의 완충 능력. 3. C2C12 근육 모세포의 세포를 사용하여 세포 외 유출 분석 실험을 수행 참고 : 단계 3.4.3에서, CO 2에는 관찰 된 차이는 존재가 HCO 3 CO 2의 완전한 전환을 위해 요구되지 않는다는 것을 시사 C2C12 문화에 탄산 탈수 효소의 존재에 산 생산에 의존 – 유래없는 있었다 – + H +. 그러나 경험적으로 다른 실험 시스템이 테스트를하는 것은 OM 전에 추천itting 탄산 탈수 효소. 배양 마우스 C2C12 11.1 mM의 글루코오스, 2 mM의 글루타민, 10 % V / V 소 태아 혈청 (FBS), 100 U 가진 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 95 % 공기 / 5 % CO 2 하에서 37 ℃에서 13 아세포 / ml의 페니실린과 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신. 24 시간 이전에 분석에 20,000 세포에서 같은 배양 배지 100 ㎕에 판 / 종자 세포 / 웰의 추가 코팅 24 웰 폴리스티렌 세포 외 플럭스 분석 플레이트 (재료 및 방법 참조). , FCCP을 oligomycin 희석하고, 크렙스 링거 인산 HEPES (KRPH) 분석 배지 (2 mM의 HEPES, 136 mM의 NaCl을, 2 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 3.7 밀리미터의 KCl, 1 로테 플러스 myxothiazol, 10 배 최종 농도의 HCl (선택 사항) 밀리미터의 MgCl 2, 37 ° C에서 1.5 mM의 CaCl2를, 0.1 % V / w 지방산 무 소 혈청 알부민, pH 7.4의). 셀 준비 30 분 전에 분석에, GE에 흡입에 의해 부착 세포를 세 번 씻는다ntly 우물에서 매체를 제거하고 천천히 500 μL KRPH를 추가. 공기 하에서 37 ℃에서 세 번째 세척 단계 후, 세포를 부화 (되지 5 % 중탄산이없는 배지의 pH를 변경한다 CO 2 이하). 분석 시작시, 추가 기판, 500 U / ㎖ 탄산 탈수 효소 및 중 포도당 (10 mM)을 또는 유일한 매체를 포함하는 500 μL 신선한 KRPH와 우물에 KRPH를 교체합니다. 센서 카트리지 넣기 포트 : 2 μg의 / ㎖ oligomycin, 포트 B : 0.5 μm의 FCCP, 포트 C (분석에서 최종 농도가 아니라 주어진) 다음과 같은 세포 외 유량 센서 카트리지의 카트리지 포트에 단계 3.3에서 제조 된 각각의 10 배 화합물의 피펫 50 μL 씩 1 μM의 로테 논, 1 μM의 myxothiazol, 포트 D : 염산 (상기 표 2에 기재된 분석에서의 산 – 교정을 행하는 경우). 주 : 완전 호흡 쇄 억제 목적을 위해 여기에 설명 된, 제 1 μMxothiazol 1 μM의 antimycin의 A.와 상호 교환 적으로 사용될 수있다 세포 외 플럭스 분석 : 10에 기술 된 바와 같이 호흡 제어를 결정하기위한 표준 외 플럭스 분석을 수행한다. 참고 실험의 각 세그먼트에 대해, 혼합 결정 기다린 측정 시간 세그먼트 당 사이클뿐만 아니라, 숫자, 소망. 주 : 표 5의 데이터는 세 가지 분석 사이클 버퍼링 교정 용 염산 (상이한 양의 포트 D를 첨가 한 후 발생하여, 2 분간 혼합, 1 분간 대기하고, 각 세그먼트에 대한 5 분 계수의 두 분석 사이클 동안 수집 된 표 2에서와 같이 전원). 표 5. 세포 외 플럭스 분석 구성. 4. MeasuriNG 엔드 포인트 젖산 농도 주 : 환원 (2 분 이상)의 초기 속도를 측정함으로써 기존의 96 웰 플레이트에서 직접 결정될 수있다 외 플럭스 실험의 끝에서 약간 다른 시스템, 엔드 포인트 젖산 농도 여기서 설명 간접 분석법를 검증 NAD + → NADH는 당사의 사전 출판 (6)에 자세히 설명 젖산 탈수소 효소에 의해 촉매. 대표 결과에 제시된 데이터, 포도당 – 함유 분석 웰에서 종점 젖산 농도는 ~ 40 μM이었다. 배 히드라진 매체를 준비 : 1 M 트리스, 20 mM의 EDTA, 400 mM의 히드라진, pH가 9.8를 22 ° C에서). 즉시 분석을 시작하기 전에, 40 U / ㎖로 4 밀리미터 및 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 NAD +를 추가합니다. 최종 분석 배지 조성물 (1X) : 500 mM 트리스, 10 mM의 EDTA, 200 mM의 히드라진, 2 mM의 NAD +, 20 U / ㎖의 LDH. 즉시 세포 외 플럭스 분석을 다음, 100을 제거불투명 (블랙)의 웰에 세포 외 플럭스 분석 플레이트 및 전사의 각 웰로부터의 분석 배지를 96- 웰 플레이트의 μL. 물론 각각의 샘플에 100 μL 배 히드라진 매체를 추가 할 수 있습니다. 즉시 마이크로 플레이트 리더로 ​​플레이트를 로딩하고 340 nm의 여기 / 460 nm의 방출에서 NADH 형광 모니터링을 시작. 약 2 분의 초기 속도를 기록한다. 0 내지 50 μM 첨가 농도에 대한 락 테이트 락 테이트 농도에 대해서 초기 속도를 플로팅하여 표준 곡선을 구성하는 유사한 실험을 실행. 각각의 실험이 잘 표준 곡선을 사용하여 젖산 농도를 계산한다. 5. 단백질 함량을 측정 분석 플레이트의 각 웰에서 남은 분석 매체를 제거합니다. 바닥 아니라 표면에서 세포의 빠지을 최소화하기 위해주의하고, BSA없는 KRPH μL 우물 (250)로 3 회 세척 할 것. 25 μL RIPA 용해 추가매체 (150 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스, 1 mM의 EGTA, 1 mM의 EDTA, 1 % V / V 트리톤 X-100, 0.5 % V / W 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % V / V SDS, 22 ° C에서의 pH 7.4) 분석 플레이트의 각 웰. 30 분 동안 얼음 접시를 품어. 5 분 동안 1,200 rpm에서 판 쉐이커에 판을 선동. 용해 완충액의 조성의 측정 방법과 호환되는 것을 보장 BCA 분석으로 예를 들어 표준 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다. 도 2의 실험에서 단백질 함량은 4 ~ μg의 / 웰이었다.