Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

1. Misurazione buffering Potenza in un extracellulare strumento Flux: due varianti NOTA: i calcoli ed i metodi qui descritti sono stati sviluppati utilizzando un extracellulare Flux Analyzer. Per gli altri strumenti, il volume di misura deve essere scalato in modo appropriato. Preparare 0,1 M di serie HCl in acqua utilizzando HCl concentrato (vedi Materiali e attrezzature), secondo le istruzioni del produttore. Nota: Un esempio di calcolo per la preparazione di iniezioni HCl per l'uso in tutte le quattro porte di iniezione è mostrato in Tabella 1: Tabella 1. consecutive iniezioni HCl in un saggio del flusso extracellulare così. Preparare diluizioni dello standard HCl nel mezzo da dosare come in tabella 1 per il numero di repliche tecniche che sono carrIED in un piatto, più uno per permettere di errore pipettamento, ad esempio, per quattro repliche tecniche della porta A iniezione, preparare uno stock di (1,1 ml x 5) 0,1 M HCl a (48,9 ml x 5) terreno di coltura. Distribuire 50 ml in ciascuna Port A della cartuccia sonda di misura. Ripetere questa procedura per i porti rimanenti B, C e D. Eseguire un test flusso extracellulare 10 con un ciclo di calibrazione standard, seguita da due cicli di [2 min mix, 1 min aspettare, e 5 min misura] per ciascuno dei quattro aggiunte di porta (vedere Figura 2). Programmare all'esperimento precedente nel software dello strumento secondo le istruzioni del software. Caricare la cartuccia disposta nella macchina ed eseguire la calibrazione secondo le istruzioni del software. Quando viene richiesto dal programma, rimuovere la piastra-calibrante contenente e inserire la piastra contenente terreno di coltura in ciascun pozzetto nello strumento; proseguire il programma. U cantare la media di 8-10 punti di dati ottenuti allo stato stazionario (tipicamente gli ultimi 8-10 punti) prima e dopo ogni aggiunta porto, calcolare il (cumulativo) differenza di pH (ΔpH) causate da ogni iniezione di acido standard. Tracciare ΔpH contro nmol H + contenuta nel volume 7 microlitri intrappolato dalla sonda di misura. La pendenza lineare è il potere di buffering (BP) in mph / pmol H +. In alternativa ai punti 1,2-1,3, effettuare le misurazioni ΔpH seguenti un test in cui le porte A, B, e C sono utilizzati per lo svolgimento di un esperimento, seguita da una iniezione di HCl a Port D. Come nella tabella 2, quattro repliche tecniche sono usato per generare ogni punto di una curva standard a 5 punti in 20 pozzi sperimentali (esclusi i pozzi quattro sfondo di correzione della temperatura) della piastra test del flusso extracellulare. 53464table2.jpg "/> Tabella 2. Single HCl iniezione in un test di flusso extracellulare bene. 2. Misura buffer di alimentazione Uso un misuratore pH esterno NOTA: Per misurare il potere tampone di un supporto tramite una sonda pH esterna, calibrare la sonda a 37 ° C e mantenere questa temperatura per tutti i reagenti durante l'esperimento. Preparare 0,1 M di serie HCl in acqua utilizzando HCl concentrato in base alle istruzioni del produttore. Sonda Warm pH, pH standard, il terreno di coltura il cui potere tampone deve essere misurata, e 0,1 M HCl a 37 ° C in un bagno d'acqua. Calibrare sonda pH a 37 ° C in base alle istruzioni del produttore. Mantenere tutti i reagenti a 37 ° C durante tutta la seduta utilizzando una lastrina di calore o bagnomaria. Aliquotare 10 ml di terreno di coltura in un piccolo beaker o tubo conico. Monitorare continuamente pH utilizzando una sonda pH immerso. Aggiungere 0,1 M HCl al comedice di medie 10-20 aliquote microlitri. Garantire la miscelazione utilizzando un ancoretta o agitando manualmente il contenitore dopo ogni aggiunta di acido. Attendere alcuni secondi per la misurazione del pH si stabilizzi, quindi registrare il pH dopo ogni aggiunta. Come dimostrato nella tabella 3, fare un numero sufficiente di aggiunte per assicurare calcolo della pendenza preciso e per coprire il ventaglio di pH previsto durante l'esperimento. Tabella 3. Misurazione potere tampone con un pH-metro. I dati rappresentano un tipico esperimento con sei aggiunte 20 microlitri di 0.1 M HCl. Plot ΔpH contro nmol H + aggiunto per 7 microlitri, dando una pendenza lineare che rappresenta il potere tampone (Figura 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 1. Determinare potere buffering. Curva standard HCl misurato come in Tabella 1, tabella 2 o (qui) come in tabella 3. La pendenza della curva di interpolazione lineare determina il potere tampone (pH / nmol H + in 7 ml). Ogni punto rappresenta media ± SEM di n = 9 replicati tecnici. Una volta che il potere di buffering è conosciuto attraverso il metodo 1 o 2 di cui sopra, convertire il segnale ECAR (mph / min) di PPR (pmol H + / min / proteine ​​mg) dividendo ECAR dal potere buffer (BP) (mph / pmol H +) e il ridimensionamento al contenuto proteico di ogni bene: PPR tot (pmol H + / min / mg di proteine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + in 7 ml) / proteine ​​per bene (mg) Equazione 6 In alternativa, utilizzare gli stessi esperimenti nel metodos 1 o 2 per calcolare la (BC) valore buffering capacità utilizzata dal software strumento per calcolare automaticamente PPR durante la raccolta dei dati. NOTA: L'utente strumento manuale 12 (pagina 107) fornisce informazioni dettagliate sul calcolo e l'utilizzo della capacità di buffering, dove aC è descritto come BC (mol / L) = moli H + / (ΔpH Volume x tampone (L)) L'equazione 7 NOTA: la capacità tampone come definito nell'equazione 7 può essere calcolato in strumento o sonda pH esterno saggi sopra descritti. La conversione tra potenza buffering e capacità tampone è fatto facilmente (vedi foglio allegato): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + in 7 ml) / 7 ml) Equazione 8 NOTA: Se noto prima di eseguire il test, il potere tampone può essere inserito direttamente nel software dello strumento durante l'installazione sperimentale. Applicare questa procedura e calcoli utilizzati in precedenza per molti sistemi tampone convenzionali, come descritto nella precedente pubblicazione 6. NOTA: La tabella 4 elenca il potere e la capacità di buffering buffer di diversi media tradizionali. Tabella 4. potere buffering e capacità tampone di supporto selezionato. 3. Esecuzione di un extracellulare Flux test utilizzando cellule dei mioblasti C2C12 NB Al punto 3.4.3, non sono state osservate differenze riguardo la CO 2 -derived produzione di acido dipende dalla presenza di anidrasi carbonica nella cultura C2C12, suggerendo che la sua presenza non è richiesta per la conversione completa di CO 2 di HCO 3 – + H +. Tuttavia, empiricamente prove in diversi sistemi sperimentali è consigliato prima omitting carbonica. Culture topo C2C12 mioblasti 13 a 37 ° C sotto 95% aria / 5% di CO 2 in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con glucosio 11,1 mM, glutammina 2 mM, 10% v / v di siero fetale bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. 24 ore prima del saggio, cellule piastra / seme in 100 ml di terreno di coltura stessa a 20.000 cellule / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti test polistirene extracellulare flusso (vedi Materiali e Metodi) senza ulteriore rivestimento. Diluire oligomicina, FCCP, e rotenone più myxothiazol, e HCl (opzionale) a 10 volte la concentrazione finale di Krebs Ringer fosfato HEPES (KRPH) a medio dosaggio (2 mM HEPES, 136 NaCl mm, 2 mm NaH 2 PO 4, 3.7 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 0.1% w / v sieroalbumina bovina grassi-acidi, pH 7,4 a 37 ° C). Preparazione delle cellule 30 min prima del test, lavare cellule aderenti tre volte aspirando a gente rimuovere il supporto dal pozzo e poi, lentamente, aggiungendo 500 microlitri KRPH. Incubare le cellule dopo il terzo fase di lavaggio a 37 ° C sotto aria (non sotto 5% di CO 2, che altererà il pH di questa coltura privo di bicarbonato). All'avvio del test, sostituire KRPH in pozzi con 500 ml KRPH fresco contenente 500 U / ml carbonica e sia il glucosio (10 mm) o unico mezzo, senza alcun supporto aggiuntivo. Caricamento della cartuccia sensore Dispensare 50 aliquote microlitri di ogni 10x composto preparato al punto 3.3 nei porti della cartuccia di una cartuccia extracellulare flusso sensore come segue (concentrazioni finali di test ben fornite): Porta A: 2 mg / ml oligomicina, Porta B: 0,5 micron FCCP, Port C : 1 mM rotenone, 1 mM myxothiazol, Port D: HCl (se eseguire una calibrazione acido-dosaggio come sopra descritto ed in Tabella 2). NOTA: ai fini della completa inibizione catena respiratoria descritto qui, 1 micron mieixothiazol può essere usato in modo intercambiabile con 1 micron antimicina A. Extracellulare test di flusso: Eseguire un test di flusso extracellulare standard per determinare il controllo delle vie respiratorie, come descritto nel 10. NOTA: Per ogni segmento dell'esperimento, determinare il mix, attendere e tempi di misurazione desiderata, così come il numero di cicli per ogni segmento. NOTA: I dati nella Tabella 5 sono stati raccolti in due cicli di dosaggio di 2 min mix, 1 min aspettare, e 5 min misura per ogni segmento, con tre cicli di dosaggio che si verificano dopo l'aggiunta Port D di diverse quantità di HCl (per la calibrazione del buffer potere come in Tabella 2). Tabella 5. extracellulare configurazione test di flusso. 4. Gamma di misurazioneng End-point concentrazione di lattato NOTA: Per convalidare il saggio indiretto qui descritto in un sistema diverso, punto di concentrazione di lattato fine alla fine di un esperimento flusso extracellulare può essere determinato direttamente in una piastra a 96 pozzetti convenzionale misurando la velocità iniziale (oltre 2 min) di riduzione NAD + → NADH catalizzata da lattato deidrogenasi, descritta in dettaglio nel nostro precedente pubblicazione 6. Per i dati presentati in Rappresentante dei risultati, il punto finale concentrazione di lattato in pozzetti contenenti glucosio era ~ 40 micron. Preparare medio idrazina 2x: 1 M Tris, 20 mM EDTA, idrazina 400 mM, pH 9,8 a 22 ° C). Immediatamente prima dell'inizio del test, aggiungere NAD + a 4 mM e lattato deidrogenasi (LDH) a 40 U / ml. Tessitura media dosaggio finale (1x): Tris 500 mM, EDTA 10 mM, idrazina 200 mM, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. Immediatamente dopo il dosaggio flusso extracellulare, rimuovere il 100ml di terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra di dosaggio flusso extracellulare e trasferimento in un pozzetto di una opaca (nero) piastra a 96 pozzetti. Per ogni campione bene, aggiungere 100 microlitri 2x medio idrazina. Caricare immediatamente il piatto in un lettore di micropiastre e iniziare a monitorare NADH fluorescenza a 340 nm di eccitazione / 460 nm di emissione. Registrare la velocità iniziale per circa 2 minuti. Eseguire un esperimento simile a costruire una curva standard tracciando velocità iniziale contro la concentrazione di lattato per le concentrazioni di lattato aggiunto 0-50 micron. Calcolare la concentrazione di lattato in ogni sperimentale pozzetto utilizzando la curva standard. 5. Misurare contenuto proteico Rimuovere restante terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra di dosaggio. Lavare i pozzetti tre volte con 250 microlitri KRPH senza BSA, facendo attenzione a ridurre al minimo il sloggiare delle cellule dalla superficie ben inferiore. Aggiungere 25 microlitri RIPA lisimedio (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v sodio desossicolato, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 a 22 ° C) a ciascun pozzetto della piastra dosaggio. Incubare la piastra in ghiaccio per 30 min. Agitare piastra su un agitatore a 1200 rpm per 5 min. Misurare concentrazione proteica con metodi standard, ad esempio, mediante test BCA, assicurandosi che la composizione del tampone di lisi è compatibile con il metodo di misurazione. Il contenuto proteico nell'esperimento di figura 2 era ~ 4 mg / pozzetto.