Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate
Summary
Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Abstract
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
Introduction
Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, den glykolytischen Rate von Zellen mit der extrazellulären Flussanalyse genau zu messen. Quantitative Messung der glykolytischen Rate unter Verwendung extrazelluläre Ansäuerung ist der gewünschte Endpunkt vieler Experimente. Allerdings ist die Gesamtrate der extrazellulären Ansäuerung die Summe aus zwei Komponenten: Atem Versauerung, in Form von CO 2 (die H 2 CO 3 distanziert dann zu HCO 3 Hydrate – + H +) und glykolytischen Versauerung, in Form Lactat – + H +.
Die Beiträge der CO 2 zum Gesamtextrazelluläre Ansäuerung bis vor kurzem wurde als geringfügig in der Messplattform zum Einsatz, der XF24 Analysator 7. Es ist jedoch klar, in mehreren anderen Systemen, die CO 2 kann einen wichtigen Beitrag zur extrazellulären Ansäuerung 4-5 sein. Mehrere Papiere bestätigen diese conBeitrag, aber versuchen Sie nicht, direkte Quantifizierung von CO 2 abgeleitete Säure 3,8,9. Wir haben kürzlich gezeigt, dass quantitativ CO 2 Produktion ist eine bedeutende Quelle der extrazellulären Ansäuerung in diesem System 6. Darüber hinaus, obwohl es mehrere Stoffwechselwege, die CO 2 aus Glukose-Katabolismus zu erzeugen, die Kontrollen durch Matrix-Dehydrogenasen in der Zitronensäure-Zyklus durchgeführt werden die überwältigende Mitwirkenden und alle anderen Quellen zu erzeugen Mengen an CO 2, die innerhalb der Fehler 6.
Ohne Korrektur für die CO 2 -Produktion ist extrazelluläre Ansäuerung daher eine mehrdeutige Indikator für glykolytische Rate und nicht quantitativ verwendet werden. Unsere früheren Veröffentlichung hebt mehrere Fälle, in denen Atmungs CO 2 umfasst den Großteil der Gesamt Ansäuerung Signal, sogar in einzelnen Zellen im Allgemeinen angenommen, dass in erster Linie nutzen Glykolyse 6. Zusätzlich kann dasAtem CO 2 Beitrag zur gesamten Ansäuerung variiert stark im Verlauf gemeinsamer metabolischer Profile Experimente zeigen, dass den genauen Vergleich der glykolytischen Rate während verschiedene Teile eines Experiment erfordert Korrektur für CO 2.
Um den glykolytischen Rate von Zellen mit der extrazellulären Ansäuerung Rate der zu messen, ist es notwendig, den pH-Wert der Entwicklung der Gesamt H + erzeugt umzuwandeln und um die extrazellulären Ansäuerung von CO 2 verursacht wird während des Betriebs des Zitronensäurezyklus freigesetzt zu subtrahieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zum Messen extrazellulären Protonenproduktionsrate (von extrazellulären pH-Änderungen und der kalibrierten Pufferkraft des Assaymediums) und CO 2 -Produktion (von extrazellulärer Veränderungen in O 2 -Konzentration) und zeigen, wie man glykolytischen Rate zu berechnen unter Verwendung dieser Messungen.
Diese Methode Stärke ens die Nützlichkeit der extrazellulären Ansäuerung Messung, indem Sie es richtig zu berechnen glykolytischen Rate wie durch Laktatproduktion definiert. Ohne Korrektur für Atem CO 2 (oder direkte Messung der Laktat), ist es unmöglich, festzustellen, ob und in welchem Umfang die Gesamt Ansäuerungsrate spiegelt glykolytischen Rate, verwechseln die Interpretation von Experimenten, die gesamte extrazelluläre Ansäuerung nutzen als direkte Messung der Laktatproduktion.
BERECHNUNGEN
CO 2 und Lactat sind, innerhalb des experimentellen Fehlers, die nur zwei Beiträge zur extrazellulären Säureproduktion, basierend auf Experimenten mit Myoblastenzellen 6. Daher kann die Rate der gesamten extrazellulären Ansäuerung (PPR, Protonenproduktionsrate) wie folgt definiert werden:
PPR tot = PPR bzw. + PPR glyc Gleichung 1
. _content "> wobei tot = Gesamt; resp = Atem; glyc = glykolytischen glykolytischen PPR ist somit:PPR glyc = PPR tot – PPR bzw. Gleichung 2
Hier,
PPR tot = ECAR tot / BP Gleichung 3
wo ECAR = extrazellulären Ansäuerungsrate (mph / min) und BP = Pufferkraft (mph / pmol H + in 7 ul), während
PPR bzw. = (10 pH-PK 1 / (1 + 10 pH-PK 1)) (max H + / A-2) (OCR tot – OCR rot / myx) Gleichung 4
wobei K 1 = kombinierte Gleichgewichtskonstante der CO 2 Hydration und Dissoziation zu HCO 3 – + H +; max H + / O 2 = the CO 2 stammenden Versauerung für eine bestimmte metabolische Umwandlung, wie vollständige Oxidation von Glucose-6; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate (pmol O 2 / min) und OCR rot / myx = nicht-mitochondrialen OCR.
Gleichung 4 Isolaten mitochondrialen OCR durch Subtrahieren jeden Nicht mitochondrialen OCR (definiert als OCR, die gegenüber der mitochondrialen Atmungsgifte Rotenon und Myxothiazol ist) und beträgt die maximale H + pro O 2 für jedes Substrat (max H + / O 2 verbraucht erzeugten ) (siehe 6), sowie der Anteil an CO 2, die zu H + in der Versuchstemperatur und pH-Wert (10 pH-PK 1 / (1 + 10 pH-PK 1). Für eine vollständige Oxidation von Glucose, mitochondrialen Sauerstoff Verbrauchsrate (OCR) ist genau gleich der Geschwindigkeit der CO 2 -Produktion. Im geschlossenen Assayvolumen von extrazellulärem Flussmessung, CO 2 erzeugend durch Atmung bleibt gefangen in dem Testmedium. + H + – der größte Teil der eingefangenen CO 2 mit H 2 CO 3, die dann dissoziiert HCO 3 hydratisiert. Eine kleine Fraktion gelöst bleibt, jedoch nicht hydratisiert, und ein anderer kleiner Anteil hydratisiert, aber nicht gespalten, da thermodynamisch durch die kombinierte Gewichtskonstante CO 2 Hydratation und Dissoziation HCO 3 diktiert – + H + bei Versuchstemperatur (37 ° C) und pH- (~ 7,4).
Somit ist die komplette Gleichung zur Berechnung PPR g durch Subtraktion PPR bzw. von PPR tot ist:
PPR glyc = ECAR tot / BP – (10 pH-PK 1 / (1 + 10 pH-PK 1)) (max H + / A-2) (OCR tot – OCR rot / myx) Gleichung 5
ichn So Raten von Atmung und Glykolyse, sowie ihre zugehörigen ATP Produktionsraten kann quantitativ aus einfachen Messungen (Sauerstoffverbrauch, extrazelluläre Ansäuerung Pufferkapazität) sowie Ein- und Berechnung der anderen erforderlichen Werten (H + / O 2 bestimmt werden, P / O, und die Gleichgewichtskonstante K 1) 6. Das hier beschriebene Experiment baut auf Standard-Techniken für die Verwendung der extrazellulären Flux Analyzer wie Seahorse XF24 10,11; für andere extrazelluläre Flussmessung Formate (zB XF E 96 oder XFP), sollten alle unten Volumina entsprechend skaliert werden.
Die Pufferleistung der Assay-Medium kann durch die Entwicklung einer Standard-Kurve entweder direkt in der extrazellulären Flussplattform oder separat mit einem kalibrierten pH-Sonde gemessen werden. Hier werden drei Optionen zur Messung von Puffern durch die extrazelluläre Flusstestmedium gegeben, einschließlich Verwendung aller INJEKTIERTan den Ports der extrazellulären Flux Analyzer mit zellfreien Probenvertiefungen oder nur mit dem letzten Einspritzöffnung in zellhaltigen Brunnen (Abschnitt 1) oder durch Verwendung eines externen pH-Messung (Abschnitt 2). Siehe die beigefügte Tabelle für die vollständige Berechnung der Beispieldaten.
Um Pufferkraft zu messen unter Verwendung des pH-Erfassungsfähigkeit der extrazellulären Flux Instruments, ist es am sichersten, zellfreien Brunnen verwenden, um Signaländerung zu minimieren. Innerhalb des Fehlers zwischen zellfreie und zellhaltigen Vertiefungen bei der Durchführung dieser Messung (Daten nicht gezeigt) besteht jedoch keine statistische Differenz. HINWEIS: Die in Schritt 1.7 beschriebenen Variante trägt den Vorteil, Buchhaltung für mögliche Änderungen an Puffern von zugesetzten Verbindungen oder durch die Anwesenheit von Zellen verliehen, mit dem Nachteil lauter Signal. Jedoch, wie oben angegeben, wurden keine signifikanten Unterschiede in der berechneten Pufferkraft zwischen dem zellfreien Design in Tabelle 1 gezeigt festgestellt unddie post-Versuchsplanung di der Tabelle 2 unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen.
Zusätzlich über kleine ApH Bereichen (<0,4 Einheiten; experimentell am besten, 0,2 Einheiten beschränkt), die lineare Steigung durch Auftragen Δ mph / pmol H erhaltenen + angemessen approximiert die logarithmische Beziehung zwischen & Dgr; pH und [H +]. Die Steigung der Standardkurve stellt daher die Pufferkraft des Assaymediums prüfenden pH / nmol H + in 7 ul oder mph / pmol H + in 7 ul. Wir empfehlen Medium Pufferkraft erhöht oder verringert Zelldichte für die Proben, die einen pH-Wert von 0,2 Einheitsänderung während der Messzeit überschreiten. Die Messzeit kann auch herabgesetzt werden, aber dies kann die stationäre Ansäuerungsrate verkürzen und Fehler in die Ratenberechnungs einzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extrazelluläre Ansäuerung ist eine leicht gemessen Angabe der zellulären Stoffwechselrate. Um richtig bestimmen die Rate der zellulären Glykolyse (wie durch Laktatproduktion definiert) ist es wichtig, die Pufferleistung der Testmedium kennen und an die extrazelluläre Flussmessungen des Sauerstoffverbrauchs und Versauerung zu konvertieren, um die Produktionsraten Proton. Mit der Durchführung dieser Berechnung kann die Versauerung von CO 2 in der Zitronensäurezyklus freigesetzt resultierenden abgezogen werden, so dass die Versauerung, die von Laktatproduktion führt.
Die mehreren verschiedenen Möglichkeiten die hier angegeben, um Pufferkraft für diese Korrektur messen tragen unterschiedliche Vor- und Nachteile. Externe Messung unter Verwendung einer pH-Sonde ist sehr genau und reproduzierbar ist, kann jedoch kleine Unterschiede im pH-Erfassung durch die in der Testplatte, die Zugabe von Verbindungen, die während des Tests, oder der Anwesenheit von t enthaltenen Fluorophore eingeführt widerspiegelner Zellen selbst. Die in-Platte pH-Messungen diese Probleme anzugehen, sondern auch die Einführung in unterschiedlichem Maße von experimentellen Lärm.
Die CO 2 Korrektur ECAR ermöglicht zum ersten Mal die eindeutige quantitative Berechnung der glykolytischen Rate und zeigt Unterschiede in respiratorische und glykolytische Beitrag zur gesamten ECAR im Verlauf eines Experiments. Unter Verwendung von Gleichung 5 und die Messungen der OCR, ECAR und Pufferung Leistung kann glykolytischen Rate mit der einfachen Tabellenkalkulation zur Verfügung gestellt (Tabelle 6) berechnet werden. Diese Rate kann durch post-hoc Laktatmessung, falls gewünscht 6 überprüft werden. In Zellen, in denen die Pentosephosphatweg hoch aktiv ist, kann die Verwendung von Pathway-Inhibitoren wie 6-Aminonicotinamid sinnvoll sein, die glycolytische Rate zu isolieren. Berechnung der Beiträge sowohl von CO 2 – und Lactat abgeleitete H + aus dem gesamten gemessenen extrazelluläre Ansäuerung Frequenz und Sauerstoff ConsumptIonen-Rate ist ein unschätzbares Werkzeug für die Verwendung von extrazellulären Flussdaten, um leistungsfähige und quantitative Aussagen über Stoffwechselaktivität zu machen.
Mit den hier beschriebenen Verfahren, einschließlich verschiedene Modifikationen zur Messung Pufferkraft und die Optimierung der für die extrazelluläre Flussexperiment für die untersuchten Zellen und die gewünschten Daten, kann die Geschwindigkeit der Glykolyse in intakten Zellen, die unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist auf Zellen, die in adhärenten Kultur auf wachsen kann (oder die Zellen oder Organellen, die geklebt werden können, um) ein Polystyroloberfläche begrenzt. Es ist sehr zuverlässig, wenn die kultivierten Zellen homogen und konfluent sind, obwohl Nutzdaten können noch über einen Bereich von diesen Bedingungen erhalten werden. Die Berechnungen erfordern einige Kenntnisse über den Stoffwechsel der Zellen, wie max H + / O 2 im Bereich von 0,65 bis 1,0 für die vollständige Oxidation von verschiedenen Substraten und zur Partialoxidation 6 jedoch, wenn die Zellen known um Glukose zu oxidieren, kann ein Wert von 1,0 ausgegangen werden.
Wenn alle relevanten metabolischen Charakterisierung kann dieses Verfahren besonders nützlich sein, wenn sie in Systemen verwendet, bei dem eine Verschiebung zwischen der Atemwege und glykolytischen Metabolismus aufrechtzuerhalten zellulären ATP-Versorgung ist eine kritische Phänotyp, einschließlich der Charakterisierung von Stammzellen und tumorderivierten Krebszellen. Das Verständnis der Stoffwechseleinstellung Veränderungen in diesen und anderen Zusammenhängen wird ein höheres Maß an Kultiviertheit und Genauigkeit bei der Versuchsplanung und Analyse dieser Zelltypen ermöglichen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Materials
| Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
| Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
| Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
| XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
| HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
| oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
| FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
| Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
| Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
| FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
| penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
| carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
| 96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
| NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
| LDH | Sigma | L1254 | chemical |
Riferimenti
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