Air дискретизацией анализ Фильтр для эндотоксинов и содержание ДНК
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
Открытый исследования аэрозоля обычно использует твердые частицы сэмпл на фильтрах. Эта процедура позволяет различным характеризации собранных частиц, которые будут выполняться параллельно. Цель метода, изложенного здесь, чтобы получить очень точную и надежную анализ содержания эндотоксина и ДНК биоаэрозолей, экстрагированных из фильтров. Экстрагирование с высокой молекулярной массой органических молекул, такие как липополисахариды, из дискретизированных фильтров включает встряхивании образца в среде свободной от пирогенов на водной основе. Последующий анализ основан на ферментативной реакции, которые могут быть обнаружены с помощью турбодиметрического измерения. В результате высокого содержания органических веществ на дискретизированных фильтров, извлечение ДНК из образцов осуществляется с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК, которая была первоначально разработана для почв и модифицируется с целью улучшения выхода ДНК. Обнаружение и количественное определение конкретных видов микроорганизмов с помощью количественной полимеразной цепи Reactiна (Q-PCR) анализа, и по сравнению с другими существующими методами.
Introduction
Отбор проб воздуха на фильтрах является основным инструментом в атмосферных исследований аэрозолей. 1 Отобранная фильтры являются отправной точкой для различных химических, физических и биологических характеристик собранных частиц окружающей среды. 2-11 Преимущество такого подхода состоит в том, что различные анализы могут быть осуществляется в автономном режиме на том же образце. Компиляция данных из всех различных анализов позволяет исследователю получить хорошее представление о характеристиках собранных частиц и помогает в решении сложных вопросов в области атмосферных наук. 12,13 Так , например, морских и внутренних воздушных проб , взятых в течение того же период можно сравнить с относительно отобранного токсичности частиц и биологического состава. 14 для данного исследования, липополисахариды (LPS), компоненты на грамотрицательных бактериальных клеточных стенок, также известные как эндотоксины, были извлечены из фильтров пробы на суше и на внутренним местом, и были оценены с помощьюЛаймулус амебоцит лизат (LAL) тест. Параллельно с этим, геномная оценка содержания бактерий (общее количество бактерий, грамотрицательных и цианобактерии) проводили на том же образце с использованием количественной полимеразной цепной реакции (Q-PCR). Тест LAL основан на измерении мутности , образующихся после добавления водного экстракта amebocytes из подковы краба, Limulus Полифема, к водному раствору , содержащему эндотоксинов. Чем выше концентрация эндотоксина в образце, тем быстрее мутность развивается. 15 Анализ Q-ПЦР на основе сигнала флуоресценции , испускаемой в качестве специфического фрагмента ДНК усиливается. 16 с помощью реального времени наблюдения сигнала во время экспоненциальной фазы ПЦР реакции и калибровочный со стандартной кривой, исходное количество ДНК может быть определена количественно. Сочетание этих двух анализов вместе с другими, как подробно описано в другом месте, 14 может обеспечить хорошую оценку уровней эндотоксина иКоличество источника бактерий в образцах.
Цель метода, изложенного здесь, чтобы получить очень точную и надежную анализ содержания эндотоксина и ДНК биоаэрозолей, экстрагированных из фильтров. В то время как методы отбора проб физические и неорганические химические характеристики аэрозолей хорошо известны и, совсем недавно, методы были разработаны , чтобы исследовать ее органического компонента вещества, 17 наблюдается скудное исследование на биологическую составляющую аэрозолей. 18 Обоснование тока способ устранить этот пробел, представляя в деталях надежный метод для извлечения, анализа и определения биологической фракции в воздухе аэрозолей. 14
Метод подробно здесь , как ожидается , найдут применение широко распространенный в биологических внутренних и наружных научно – исследовательских проектов , связанных с аэрозольных фильтров анализа. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа описывает экстракции и обнаружения методов количественной оценки как эндотоксины и ДНК, присутствующей в аэрозольных пробах, собранных на фильтрах. Эти методы требуют точных процедур и могут быть выполнены легко, пока экспериментатор придерживается несколько существенны?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
Riferimenti
- Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
- Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
