Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l'analisi immunologiche di piccole inquinanti
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
Si propone un nuovo metodo per l'estrazione in fase solida (SPE) di campioni di acqua ambientale. Il prototipo sviluppato è conveniente e facile da usare, e consente di eseguire un rapido, automatizzato e semplice SPE. La soluzione pre-concentrata è compatibile con l'analisi mediante immunodosaggio, con un basso contenuto di solvente organico. Un metodo è descritto per l'estrazione e pre-concentrazione di ormone naturale 17β-estradiolo in 100 ml campioni di acqua. Fase inversa SPE viene eseguita con sorbente ottadecil-silice e eluizione avviene con 200 ml di metanolo al 50% v / v. Eluente viene diluito con l'aggiunta di acqua per abbassare la quantità di metanolo. Dopo aver preparato manualmente colonna SPE, la procedura generale viene eseguita automaticamente entro 1 ora. Al termine del processo, la concentrazione di estradiolo è misurato utilizzando un commerciale immuno-adsorbente assay enzimatico (ELISA). 100 volte pre-concentrazione si ottiene e il contenuto di metanolo in solo il 10% v / v. Recuperi completi della molecolavengono raggiunti con 1 ng / L spillo campioni deionizzata e sintetici acqua di mare.
Introduction
La preparazione del campione è un passo importante in ogni processo di analisi. In particolare, la rimozione degli effetti matrice, diminuzione delle interferenze e arricchimento dell'analita sono necessari per ottenere risultati precisi e raggiungere limiti di rilevabilità. Sistema endocrino composti (IE) sono di particolare interesse per la loro azione su organismi viventi, anche quando presenti a livelli molto bassi per l'ambiente. L'ormone naturale 17β-estradiolo è presente sul inquinamento delle acque dell'UE selezione e soggetto ad essere aggiunto alla lista delle sostanze prioritarie disciplinati dalla direttiva quadro sulle acque europee. Estrazione in fase solida (SPE) è comunemente applicato per l'analisi di piccole inquinanti in acqua, sia chimica 1-5 (cromatografia, spettrometria di massa) e immunologici 6-9 metodi di rilevamento. Quest'ultimo ha guadagnato interesse nel campo del monitoraggio ambientale, come saggi immunologici sono disponibili in un'ampia varietà di formati, sono specifici per la taanalita rget, e raggiungere limiti di rilevabilità. 6, 7, 10, 11 Vari Enzyme Linked immunoassorbimento (ELISA) sono commercialmente disponibili e consentono di analizzare più campioni contemporaneamente su una piastra multi-pozzo. La procedura consiste in fasi successive di reazione che possono prendere un paio d'ore. Il prodotto finale di reazione può essere rilevato otticamente per determinare la concentrazione della molecola bersaglio sulla base di una curva di calibrazione.
Procedure SPE Classical includono sorbente pre-condizionamento, dell'estrazione del campione, lavaggio, eluizione e concentrazione per evaporazione dell'eluente. Il solvente utilizzato per la diluizione di questo estratto è scelto in funzione del metodo di rilevamento. Per i metodi immunologici, la quantità di solvente organico influenze fortemente la sensibilità del metodo. 12
Oltre al recupero e le prestazioni pre-concentrazione, il metodo deve anche essere semplice ed economicamente conveniente. Automazione dei SEGUIRE IL PROCEDIMENTOe aiuta a ridurre gli errori umani legati. Nel nostro lavoro precedente 13 abbiamo introdotto il nostro prototipo per SPE automatizzata, e il nostro metodo è stato applicato all'analisi della ormone naturale 17β-estradiolo in campioni di acqua di mare. Con la presente il video che vorremmo evidenziare i vantaggi tecnici del nostro metodo rispetto alle tradizionali off-line e on-line SPE, e la sua particolare compatibilità con rilevamento da immuno-reazioni. Descriviamo il protocollo applicato ai campioni di acqua per la rilevazione di 17β-estradiolo. SPE viene eseguita con octadecil-silice (C18) Fase sorbente e eluizione viene eseguita con metanolo diluito.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato proposto un nuovo metodo per la preparazione dei campioni di acqua seguita da analisi mediante immunodosaggio. Lo strumento permette di eseguire l'estrazione in fase solida in modo automatizzato e facile da usare.
La filtrazione del campione di acqua prima della sua iniezione nel sistema è critica. Eventuali particelle ancora presenti nella soluzione potrebbe potenzialmente causare l'intasamento della rete fluidica e ostacolare colonna SPE. Un altro passo importante è la p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
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