Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
Um novo método de extracção em fase sólida (SPE) de amostras de água do ambiente é proposto. O protótipo desenvolvido é amigável custo-eficiente e usuário, e permite realizar SPE rápido, automatizado e simples. A solução de pré-concentrado é compatível com a análise por imunoensaio, com um conteúdo de solvente orgânico de baixo. É descrito um método para a extracção e concentração da pré-hormona natural 17β-estradiol em 100 ml de amostras de água. SPE de fase reversa é efectuada com octadecil-sílica adsorvente e a eluição é feita com 200 ul de metanol a 50% v / v. Eluente é diluída por adição de di-água para baixar a quantidade de metanol. Depois de preparar manualmente a coluna SPE, o procedimento geral é realizada automaticamente dentro de 1 hora. No final do processo, a concentração de estradiol é medido usando um ensaio imuno-sorvente comercial ligado a enzima (ELISA). 100 vezes pré-concentração é conseguida e o teor de metanol em apenas 10% v / v. Recuperações de pleno direito da moléculasão alcançados com 1 ng / L amostras adicionadas desionizada e água do mar sintética.
Introduction
A preparação da amostra é uma etapa importante em qualquer processo analítico. Em particular, a remoção dos efeitos de matriz, diminuição das interferências, e enriquecimento da substância a analisar são necessárias para obter resultados precisos e atingem baixos limites de detecção. Compostos de desregulação endócrina (EDC) são particularmente preocupantes devido à sua ação sobre os organismos vivos, mesmo quando presentes em níveis muito baixos no meio ambiente. O hormônio natural 17β-estradiol está presente na poluição da água UE Watch List e propenso a ser adicionado à lista de substâncias prioritárias regulamentados pela Directiva-Quadro da Água da UE. Extracção em fase sólida (SPE), é geralmente utilizado para a análise de pequenas poluentes na água, com tanto química 1-5 (cromatografia, espectrometria de massa) e métodos de detecção imunológicos 6-9. Este último ganhou interesse no campo da monitorização ambiental, como imunoensaios estão disponíveis em grande variedade de formatos, são específicas para a TArPegue analito, e atingir baixos limites de detecção. 6, 7, 10, 11 Vários ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA) estão comercialmente disponíveis e permitem analisar várias amostras ao mesmo tempo sobre uma placa multi-poços. O procedimento consiste em passos de reacção sucessivos que podem levar algumas horas. O produto final da reacção pode ser detectado opticamente para determinar a concentração da molécula alvo com base em uma curva de calibração.
SPE procedimentos clássicos incluem sorvente pré-condicionado, extracção da amostra, a lavagem, a eluição, e concentração por evaporação do eluente. O solvente utilizado para a diluição deste extracto é escolhido dependendo do método de detecção. 12 Para os métodos imunológicos, a quantidade de solvente orgânico influências fortemente a sensibilidade do método.
Para além da recuperação e os desempenhos de pré-concentração, o método também tem de ser simples e de custo eficiente. Automação do Procedure ajuda a reduzir erros humanos-relacionados. No nosso trabalho anterior 13 que introduzida a protótipo para SPE automatizado, e o nosso método foi aplicado para a análise da hormona natural 17β-estradiol nas amostras de água do mar. Com o presente vídeo, gostaríamos de destacar as vantagens técnicas do nosso método em comparação com off-line tradicional e on-line SPE, e em particular a sua compatibilidade com detecção por imuno-reacções. Nós descrevemos o protocolo aplicado a amostras de água para a detecção de 17β-estradiol. SPE é realizada com octadecil-silica (C18) de fase sorvente e a eluição é realizada com metanol diluído.
Protocol
Representative Results
Discussion
Foi proposto um novo método para a preparação de amostras de água seguida por análise utilizando imunoensaio. O instrumento permite realizar extração em fase sólida de forma automatizada e fácil de usar.
A filtração da amostra de água antes da sua injecção no sistema é crítico. Quaisquer partículas ainda presentes na solução seria, potencialmente, causar o entupimento da rede de fluidos e obstruir a coluna de SPE. Outro passo importante é a preparação da coluna de SPE. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
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