שיטה פשוטה למיצוי שלב המוצק האוטומטי של דגימות מים לניתוח החיסוני של מזהמים קטנים
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
שיטה חדשה להפקה מוצקה שלב (SPE) של דגימות מים סביבתיות מוצעת. אב הטיפוס שפותח הוא יעיל וחסכוני וידידותיות למשתמש, ומאפשר לבצע SPE מהיר, אוטומטי ופשוט. הפתרון מראש מרוכז תואם ניתוח על ידי immunoassay, עם תוכן ממס אורגני נמוך. שיטה מתוארת לחילוץ ומראש ריכוז של 17β-אסטרדיול הורמון טבעי במיליליטר 100 דגימות מים. שלב הפוך SPE מתבצע עם סופג octadecyl-סיליקה וelution נעשה עם 200 μl של מתנול 50% V / V. Eluent מדולל על ידי הוספת di-מים כדי להפחית את הכמות של מתנול. לאחר ההכנה ידנית עמודת SPE, ההליך הכולל מתבצע באופן אוטומטי בשעה 1. בסופו של התהליך, ריכוז אסטרדיול נמדד באמצעות assay מסחרי צמוד אנזים חיסוני-סופג (ELISA). טרום ריכוז של פי 100 מושגת ותוכן מתנול רק 10% V / V. החלמה מלאה של המולקולההם השיגו עם 1 ננוגרם / L ממוסמר דגימות מי ים דה מיוננים וסינתטיות.
Introduction
לדוגמא הכנה היא צעד חשוב בכל תהליך אנליטי. בפרט, הסרת אפקטי מטריקס, ההפחתה של הפרעות, והעשרה של אנליטי נחוצות כדי להשיג תוצאות מדויקות ולהגיע גבולות נמוכים של גילוי. תרכובות האנדוקרינית לשבש (EDCs) הן מדאיגות במיוחד בשל פעולתם באורגניזמים החיים, גם כאשר הרמות נמוכות מאוד בהווה בסביבה. 17β-אסטרדיול ההורמון הטבעי קיים בזיהום המים האיחוד האירופי רשימת מעקב ונוטה להוסיף לרשימה של חומרי עדיפות מוסדרים באירופה המים מסגרת ההוראה. מיצוי שלב מוצק (SPE) מיושם בדרך כלל לניתוח של מזהמים קטנים במים, עם שני הכימית 1-5 (כרומטוגרפיה, ספקטרוסקופיית מסות) ושיטות זיהוי חיסוניות 6-9. האחרון זכה להתעניינות בתחום הניטור סביבתי, כimmunoassays זמין במגוון רחב של פורמטים, הם ספציפיים לת"אאנליטי r קבל, ולהגיע לגבולות נמוכים של גילוי. 6, 7, 10, 11 מבחני שונים אנזים קשור immunosorbent (ELISA) זמינים מסחרי ולאפשר לנתח דגימות מרובות בבת אחת על צלחת רב גם. ההליך מורכב בצעדי תגובה רצופים שיכול לקחת כמה שעות. המוצר הסופי של תגובה יכול להיות מזוהה אופטי כדי לקבוע את הריכוז של מולקולת היעד המבוססת על עקומת כיול.
נהלי SPE קלאסיים כוללים סופג מראש אוויר, חילוץ מדגם, כביסה, elution, וריכוז על ידי אידוי של eluent. הממס המשמש לדילול של תמצית זו נבחר בהתאם לשיטת זיהוי. לשיטות חיסוניות, הסכום של השפעות ממס אורגניות מאוד את הרגישות של השיטה. 12
בנוסף להתאוששות וההופעות טרום ריכוז, השיטה גם צריכה להיות פשוט ועלות יעילה. אוטומציה של procedurדואר עוזר להפחית שגיאות הקשורות לאדם. בעבודה הקודמת שלנו 13 הצגנו אב הטיפוס שלנו לSPE האוטומטי, והשיטה שלנו הייתה מוחלת על הניתוח של 17β-אסטרדיול ההורמון הטבעי בדגימות מי ים. עם הווידאו הנוכחי ברצוננו להדגיש את היתרונות הטכניים של השיטה שלנו בהשוואה לoff-line מסורתי ועל שורת SPE, והתאימות המסוימת שלה עם זיהוי על ידי חיסוני תגובות. אנו מתארים את הפרוטוקול מיושם על דגימות מים לגילוי 17β-אסטרדיול. SPE מתבצע עם octadecyl-סיליקה שלב סופג (C18) וelution מתבצע עם מתנול המדולל.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה חדשה להכנת דגימות מים ואחריו ניתוח באמצעות immunoassay הוצעה. המכשיר מאפשר לבצע מיצוי שלב מוצק בצורה אוטומטית וידידותי למשתמש.
הסינון של דגימת המים לפני הזרקתו למערכת הוא קריטי. כל חלקיקים שעדיין קיימים בפתרון היה פוטנציאל לגרום…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
Riferimenti
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
