細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

ポリマービーズへのタンパク質の1。化学カップリングチオールアミン方向性結合注意：このプロトコルは、タンパク質が、スルホスクシンイミジル4-（p個の -maleimidophenyl）ブチレート架橋剤として（スルホSMPB）（ 図1）を使用して 、ポリマービーズを官能アミンを含有するシステインの結合に適しています。 図1の架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオール-アミンカップリングのために使用される戦略を。アミン変性ポリスチレンビーズは、スルホSMPBで活性化されています。マレイミドは、ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 試薬の調製： PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 </lI> 使用直前に100倍の株式TCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）の（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの）を準備します。 使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。 使用直前にシステイン（PBS、pHを7.0 mlの500 mMのか、88ミリグラム/）10倍の在庫を準備します。 ビーズの活性化： 静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。 静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。 慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。 、新たに調製した10mMのスルホSMPBの200ミリリットルを追加し、最終的なコンセントを与えること2 mMのの比。 回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をインキュベートします。 タンパク質の削減： それはすぐに活性化したビーズに添加することができるように、活性化工程のインキュベーション期間中、次のカップリング工程のためのタンパク質を調製します。 注：この還元工程は、常に、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）融合タンパク質のために必要とされていないが、それは高い結合効率を確保することをお勧めします。 タンパク質濃度を確認し、カップリング反応に必要な最終濃度に調整。注：PBSで6 mMのタンパク質、および1 mlの容量は、通常使用されています。 5 mMのの最終濃度を得TCEPの株式を追加します。 RTで30分間溶液をインキュベートします。 注：反応混合物を直接、次のカップリング反応のために使用することができます。 プロを決定するためにタンパク質溶液の少量（数ml）を保持テイン濃度および結合効率の計算（セクション2を参照）。 タンパク質カップリング工程： 遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によって活性化ビーズをペレット化し、新鮮な滅菌PBS 1 mlに一回ペレットを洗浄。 所望のタンパク質濃度を与えるように、調製したタンパク質溶液（ 例えば 、1 ml）にペレットを再懸濁。 注：カップリング工程中のタンパク質濃度は平均カップリング効率（結合効率のための決意セクション2を参照）、（1.1.4.3で計算されるように）所望の結合密度に依存します。カップリング工程中のタンパク質濃度は約6mmであるべきであるので、効率は、約85％と10倍ビーズ懸濁液中の所望の最終濃度5 mMです。 以下の式を使用してカップリング密度を計算します。 JPG "/>ここで、 ρcの結合密度[タンパク質分子の数/ nmで2] タンパク質濃タンパク質濃度[mg / mlの】 タンパク質M、タンパク質分子量[ダ] ワット ビーズ濃ビーズ濃度[ビーズの数/ L]、 Dビーズ直径[NM 2] アボガドロ数平均リガンド間隔を計算するために、結合密度を使用します。 回転ホイール上で25℃で2時間のためのタンパク質 – ビーズ懸濁液をインキュベートします。 注：一部のタンパク質は、室温で安定していない可能性があります。これらの場合、反応は4°CO / Nで行うことができます。 50mMの最終濃度にシステインストックを添加することによって、ビーズ上の残りの活性基を失活し、回転ホイール上で25℃で30分間、懸濁液をインキュベートします。遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によりビーズをペレット化。 タンパク質濃度との結合効率の計算を決定するために、上清を保持し（セクション2を参照）。 最終生成物を得た新鮮なPBS 1ml中に1mlのPBS再懸濁で二回ビーズペレットを洗浄します。 注：上記の手順は、通常、次の実験のための10×ストックとして使用することができる5mMのタンパク質、（セクション3参照）の最終濃度で、結合したタンパク質を1ml​​を与えます。 プロトコルのセクション3に進むには、ビーズストックの100ミリリットル/ mlの仕事、または500 nmのタンパク質の最終濃度で。注：このprocedurための良い出発点eは2 nm以下、直径2mmのビーズ上の57ナノメートルの平均間隔は3×10 -4タンパク質/平均結合密度が得られ、2×10 12ビーズ/ mlとなります。 チオールカルボキシ方向性結合注意：このプロトコルは、カルボキシル官能化ポリスチレンビーズのタンパク質を含有するシステインを結合するのに適しています。カルボキシル部分は、最初に、修正されたアミン、次 ​​に架橋スルホSMPB（ 図2）を用いて、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）/ N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を用いて活性化されます。 図2架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオールカルボキシルカップリングのために使用される戦略である。カルボキシル化ポリスチレンビーズは、最初にEDCで活性化し、半安定NHSエステルを形成するために、NHSで修飾されています。 ethylenediのその後のアミンカップリングスルホSMPBと反応する遊離アミン基、アミン結果。マレイミドは、ビーズが、その後ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応することができる活性化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 試薬の調製： PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 使用直前のTCEP（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの、）100×ストックを準備します。 使用直前に、EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の10Xストック（20mMの、またはPBS中に4mg / ml）を準備します。 10倍株式のNHS（PBS中の50mM、または6 mg / mlの）（N-ヒドロキシ）使用直前に準備をします。 使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。 システインの10倍の株価（500 mm以上のPBS、pH7.0の中で88 mg / mlの）を準備し、すぐにBEFORE使用。 ビーズの活性化： 静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。 静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。 慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。 新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。 10倍のEDCの株式の100ミリリットル（2 mMの最終濃度）とビーズ懸濁液に10倍のNHSストック溶液（5 mMの最終濃度）の直後に100ミリリットルを追加します。 回転ホイール上で25℃で30分間、ビーズ懸濁液をインキュベートします。 一度0.8ミリリットルでPBSおよび再懸濁し、1mlの新鮮な滅菌PBSでビーズを洗浄します。 200ミリリットルエチレンジアミンを追加し、INC回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をubate。 1mlのPBSで一回ビーズを洗浄し、新鮮なPBS 0.8 ml中にビーズを再懸濁します。 セクション1.1.2で説明したようにセクション1.1.2.4（スルホSMPBとビーズ活性化）から進み、セクション1.1（チオール – アミン方向性結合）に記載されているプロトコルの残りの部分に従ってください。 1.1節で説明したものと同一の方法で、タンパク質調製物とタンパク質カップリング手順を実行します。 注：（約75％）は、このプロトコルを使用する典型的なカップリング効率は、従って、同一の結合密度を達成するために、それに応じて、最初のタンパク質濃度を調節セクション1.1と比較して、わずかに低いです。 結合効率の2決意注：以下のようにブラッドフォード試薬10と比色アッセイ、タンパク質濃度を決定するために使用します。 静かEにブラッドフォード試薬を反転試薬のnsure均一。 10 mg / mlのBSAストック溶液を用いて、緩衝液中で0.1〜1.5 mg / mlのBSAの濃度をカバーするタンパク質標準を準備します。 96ウェルプレートのウェルにブラッドフォード試薬の250ミリリットルを追加します。 （緩衝液のみ）すべてのサンプル、タンパク質標準および陰性対照のための十分な井戸を準備します。 96ウェルプレート中の試薬に（ネガティブコントロールのためのタンパク質標準またはバッファ）タンパク質試料の5ミリリットルを追加します。 室温で10分間、オービタルシェーカー上でプレートをインキュベートします。 プレートリーダーを用いて595 nmの吸光度を測定します。 A595 nmの対BSA濃度の標準曲線を作成し、初期および上清サンプル中のタンパク質濃度を決定するために、これを使用しています。 次のように結合したタンパク質の濃度を計算します。 などのカップリング効率を計算します。 00eq4.jpg "/> 競合アッセイでビーズ結合アドヘシンの3. 調製： 細胞は、実験前に開始し、約80％コンフルエンシーに到達させるために24ウェルプレートにシード15万細胞/ mlの濃度でHeLa細胞のウェルあたり1 mlの競合アッセイの前日、。 三連で各実験条件を設定します。ネガティブコントロールのウェル（競合アッセイの間に追加された細菌なし）、陽性対照および（細胞毒性実験のための）溶解コントロール（のみの競合アッセイの間に追加された融合タグに結合された制御ビーズ）が挙げられます。 Vの新鮮なコロニーを5ミリリットル海洋LB（MLB）培養物に接種腸炎と揺れ、30℃でO / Nを育てます。 部1（カップリング）で説明したように、十分なビーズ結合MAMを準備します。ウェル当たり10倍のビーズストックの100ミリリットルのために許可します。 競合アッセイ： competitの日にイオン実験は、細菌培養物のOD 600を測定します 。 添加剤を含まない無色のDMEMに細菌培養物を希釈することにより、感染培地を用意し、10％（v / v）のビーズ懸濁液を含む37℃、（アドヘシン結合ビーズまたはコントロールビーズのいずれか）に予め温め、1ミリリットルを準備し10のMOIを与えること/ウェルとサンプルあたり10〜20％の過剰量。注：上記の条件（24ウェルプレート、 腸炎ビブリオ 、10 MOI）、O / N培養の必要量について培養3 / OD 600として計算されたウェル（ミリリットル/ ml）をあたりに添加されます。例えば、感染培地1mlを、典型的には、細菌培養の数mlを100 mlのビーズ懸濁液を含み、無色、非補充DMEMで1 mlまでなされます。 井戸から古い培地を除去し、各ウェルに37℃に予め温めておいた滅菌PBSを1mlを追加することで、培養したHeLa細胞を洗います。 PBSを削除して、ウェル当たりの感染培地1mlを加えます。また、ソリューションの続きを加えることで、コントロールを設定0.1％トリトンX-100（細胞毒性の測定のために、唯一の必要な溶解制御）を含有する対照ビーズおよび細菌（陽性対照）または付着ビーズおよび細菌なし（陰性対照）、またはDMEMをaining。 所望の時間（例えば、細胞毒性の測定のために4時間、または接着の測定のために1時間）37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートします。 注：宿主細胞における細菌の接着および細胞毒性の両方は阻害の有効性のために読みアウトとして使用することができます。細胞毒性および接着の測定の時点とが一致した場合、細胞毒性は、培養上清を使用して決定されるので、両方のアッセイは、同一のウェルからのサンプルを用いて行ってもよいし、付着アッセイは、残りの細胞層に由来するサンプルを使用。 細胞毒性の測定： 示された時点（ 例えば 、4時間後に感染症）で、各24ウェルから3回200ミリリットルを削除してに転送96ウエルプレート。 1,500×gで96ウェルプレートを回転、5分間よく新鮮な96ウェルプレートにそれぞれから100 mlのを転送します。 （これらはブランクとして使用されます）三連で96ウェルプレートのウェルに新鮮な感染実験の際に使用されるメディアの100ミリリットルを追加します。 LDH細胞毒性検出キットを用い、製造業者の説明書に従って、乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイを行います。 簡単に述べると、25単位で必要な試薬の量を計算する（62サンプルが測定される場合、例えば 、75などのための十分な試薬混合物を構成します）。 例えば、100サンプルに対して、試薬Bの反転の250μlの試薬Aの11.25ミリリットルを混ぜ、発泡避けるために渦をしないでください。 マルチチャンネルピペットでピペッティングすることができるように容器内の混合物を入れてください。各サンプルに100μlの試薬混合物を追加します。 室温でプレートをインキュベートし、10、20、30分でプレートリーダーで490 nmの吸光度を読み取ります。 </lI> 溶解コントロールサンプルの吸光度が高いが、それでもプレートリーダー（典型的には、2-3吸光度単位）の線形範囲内にあるために、データセットを分析します。 変換のために次の式を使用して、％細胞毒性として結果を表現します： 細菌付着の測定： 示された時点（ 例えば 、1時間後に感染症）で、細胞層からメディアを削除します。 徹底的に任意の非付着細胞を除去するために、滅菌、予め温めておいたPBS（1mlのPBSそれぞれの少なくとも3〜4回の洗浄）で細胞層を洗浄します。 ウェルあたりPBS中のTriton X-100溶液vの/無菌の1％vの1ミリリットルを添加することにより溶解する宿主細胞。 5分間37℃でプレートをインキュベートします。 各サンプルを上下に数回、1.5 mlチューブを分離するために、各ウェルの内容を転送する前にピペット。サンプルの10倍連続希釈液を調製します無菌PBSに（例えば、サンプルの100ミリリットルのPBS 900ミリリットルを使用します）。 プレートMLB寒天上で、各サンプルの100 mlの細胞スプレッダーを用いて広げました。細菌株および時点に応じて、プレートに希釈をする最適化します。注：記載された実験のセットアップについては、10 5または10 6倍希釈は、CFUの適切な数を与えます。 37°のCO / Nでプレートをインキュベートし、コロニー計数によって細菌を列挙。