Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

1. Chemische Kopplung von Proteinen an Perlpolymerisates Thiol-Amin-Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für Kopplung von Cystein enthaltenden Proteinen zu Amin-funktionalisierten Polymerkügelchen mit Sulfosuccinimidyl-4- (p maleimidophenyl) butyrat (Sulfo-SMPB) als Vernetzungsmittel (1). Abbildung 1. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-Amin-Kupplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Aminmodifizierten Polystyrol-Kügelchen sind mit Sulfo-SMPB aktiviert. Die Maleimid reagiert mit freien Cysteine ​​zu koppeln, Proteine, um Perlen gerichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Herstellung der Reagenzien: Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS) von TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein unmittelbar vor der Verwendung. Bead-Aktivierung: Mischen die Perlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. Fügen Sie 200 ml frisch hergestellte 10 mM Sulfo-SMPB, um eine endgültige concent gebenration von 2 mm. Inkubieren der Perlen-Suspension für 1 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Protein-Reduktion: Während der Inkubationszeit der Aktivierungsschritt vorzubereiten, die das Protein die folgenden Kupplungsschritt so kann sie sofort an die aktivierten Beads zugesetzt werden. Anmerkung: Obwohl diese Reduktionsschritt nicht immer für GST (Glutathion-S-Transferase) Fusionsproteine ​​erforderlich ist, wird empfohlen, eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten. Überprüfen der Proteinkonzentration und stellen sie auf die Endkonzentration für die Kupplungsreaktion erforderlich. Anmerkung: 6 mM Protein in PBS, und ein Volumen von 1 ml werden in der Regel verwendet. In TCEP Lager, um eine Endkonzentration von 5 mM zu ergeben. Inkubieren der Lösung für 30 min bei RT. Anmerkung: Das Reaktionsgemisch kann direkt für die folgende Kupplungsreaktion verwendet werden. Behalten eine kleine Menge (einige ml) der Proteinlösung für die Bestimmung der pro Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). Protein-Kupplungsschritt: Pellet die aktivierten Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge) und wasche das Pellet einmal in 1 ml frischer steriler PBS. Das Pellet in die vorbereitete Proteinlösung (zum Beispiel 1 ml), um das gewünschte Proteinkonzentration zu ergeben. Achtung: Die Proteinkonzentration während der Kupplungsschritt wird auf die durchschnittliche Kupplungseffizienz (siehe Abschnitt 2 zur Bestimmung der Kopplungseffizienz) und der gewünschten Kupplungsdichte (wie in 1.1.4.3 berechnet) abhängen. Der Wirkungsgrad etwa 85%, und die gewünschte Endkonzentration 5 mM im 10x Perlensuspension, so Proteinkonzentration während der Kupplungsstufe sollte ungefähr 6 mm betragen. Berechnung der Kupplungsdichte unter Verwendung der folgenden Formel: jpg "/> wobei ρ c Kupplungsdichte [Anzahl der Protein-Moleküle / nm 2], Protein konzentrierter Proteinkonzentration [mg / ml] Protein M w Proteinmolekulargewicht [da], Wulst konz Perlenkonzentration [Anzahl der Perlen / L], d Perlendurchmesser [nm 2] Avogadro-Zahl Verwenden Sie die Kupplungsdichte, um die durchschnittliche Ligand Abstand berechnen: Inkubieren der protein Bead-Suspension 2 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweis: EinigeProteine ​​können nicht stabil sein bei RT. In diesen Fällen kann die Reaktion bei 4 ° CO / N ausgeführt werden. Deaktivieren verbleibenden aktivierten Gruppen auf den Perlen durch Zugabe von Cystein-Lager bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und Inkubation der Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Pellet die Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge). Halten Sie den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). Zweimaliges Waschen der Bead-Pellet mit 1 ml PBS und resuspendieren in 1 ml frischem PBS, um das Endprodukt zu ergeben. Hinweis: Das obige Protokoll wird in der Regel geben, 1 ml gekoppelten Protein, in einer Endkonzentration von 5 mM Protein, das als 10x Lager für nachfolgende Experimente (siehe Abschnitt 3) verwendet werden kann. Um in Abschnitt 3 des Protokolls gehen, arbeiten mit 100 ml / ml Bead Lager, oder in einer Endkonzentration von 500 nM Protein. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt für diese procedure ist 2 × 10 12 Perlen / ml sein, was zu einer durchschnittlichen Kupplungsdichte von 3 × 10 -4 Proteine ​​/ nm 2 oder einem mittleren Abstand von 57 nm auf einem Kügelchen von 2 mm Durchmesser. Thiol-Carboxy Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kopplung Cystein enthaltenden Proteinen an carboxylfunktionalisierten Polystyrolperlen. Die Carboxylgruppe zunächst mit 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) / N-Hydroxysuccinimid (NHS), modifizierte Amin und anschließend vernetzt mit Sulfo-SMPB (Figur 2) aktiviert wird. Abbildung 2. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-carboxyl Kopplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Carboxylierte Polystyrolkügelchen werden zunächst mit EDC aktiviert und mit NHS modifiziert, um eine semistabile NHS-Ester zu bilden. Nachfolgende Amin-Kopplung ethylenediAmin führt zu einer freien Amingruppe, die sich mit Sulfo-SMPB reagiert. Maleimid aktivierte Kügelchen können dann mit freien Cysteinen reagieren paar Proteine, um Perlen gerichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Herstellung der Reagenzien: Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS,) von TCEP unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie eine 10-faches (20 mM oder 4 mg / ml in PBS) EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie eine 10-faches (50 mM, oder 6 mg / ml in PBS) des NHS (N-Hydroxysuccinimid) unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein sofort bevor Gebrauch. Bead-Aktivierung: Mischungsperlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. 100 ml 10-fach EDC Lager (2 mM Endkonzentration) und sofort 100 ml 10x NHS-Stammlösung (5 mM Endkonzentration) auf die Partikelsuspension. Inkubieren der Perlen-Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Einmal zu waschen Kügelchen in 1 ml PBS und resuspendieren in 0,8 ml frischem sterilem PBS. In 200 ml Ethylendiamin und incUbate die Perlensuspension 1 Stunde bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml PBS und Resuspendieren der Kügelchen in 0,8 ml frischem PBS. Gehen Sie aus dem Abschnitt 1.1.2.4 (Wulst Aktivierung mit Sulfo-SMPB) wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben und folgen Sie den Rest des in Abschnitt 1.1 (Thiol-Amin-Richtungskopplungs) beschriebenen Protokoll. Führen Proteinpräparat und Protein-Kopplungsschritte in einer Weise identisch zu denen in Abschnitt 1.1 beschrieben. Hinweis: Die typische Kopplungseffizienz unter Verwendung dieses Protokolls ist etwas niedriger im Vergleich zum Abschnitt 1.1, also die anfängliche Proteinkonzentration entsprechend anpassen, um die gleiche Kopplungsdichte zu erreichen (ca. 75%.). 2. Bestimmung der Kopplungseffizienz Hinweis: Um festzustellen, Proteinkonzentration, verwenden Sie Bradford-Reagenz 10 und kolorimetrische Assays wie folgt: Vorsichtig umdrehen Bradford-Reagenz bis e Nsure Homogenität des Reagens. Unter Verwendung einer 10 mg / ml BSA-Stammlösung, prepare protein Normen für Konzentrationen von 0,1 bis 1,5 mg / ml BSA in Puffer. Man 250 ml Bradford Reagenz in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Vorbereitung genug Vertiefungen für alle Proben, Proteinstandards und negative Kontrollen (nur Puffer). 5 ml der Proteinprobe (Proteinstandards oder Puffer für die Negativkontrolle), um das Reagenz in der 96-Well-Platte. Inkubieren der Platte auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur für 10 min. Messung der Extinktion bei 595 nm mit einem Plattenlesegerät. Generieren Sie eine Standardkurve der BSA-Konzentration gegen die A595 nm und nutzen diese, um Proteinkonzentrationen in der Aus- und Überstandsproben zu bestimmen. Wird die Konzentration des gekoppelten Proteins wie folgt: Berechnung der Kopplungseffizienz als: 00eq4.jpg "/> 3. Verwendung von Bead-gekoppelter Adhäsine in Konkurrenztests Vorbereitung: Samen 1 ml pro Vertiefung von HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 150.000 Zellen / ml in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor der Kompetitionsassay, sodass die Zellen etwa 80% Konfluenz vor dem Beginn des Experiments zu erreichen. Richten Sie jeden experimentellen Zustand in dreifacher Ausfertigung. Fügen Brunnen für die negativen Kontrollen (keine Bakterien während der Konkurrenz-Assays hinzugefügt), positive Kontrollen (Kontrollkügelchen, um die Fusion-Tag nur während Kompetitionsassays hinzugefügt gekoppelt) und Lyse Kontrollen (Zytotoxizität Experimente). Impfen eine 5 ml marine LB (MLB) Kultur mit einer frischen Kolonie V. parahaemolyticus und wachsen O / N bei 30 ° C, zu zittern. Bereiten Sie ausreichend Kügelchen gekoppelt MAM, wie in Kapitel 1 (Kupplung) beschrieben. Lassen Sie für 100 ml 10x Korn Stock pro Vertiefung. Competition Assay: Am Tag der competitIonen-Experiment messen die OD 600 der Bakterienkultur. Bereiten Infektion Medien durch Bakterienkulturen in farblose DMEM ohne Zusätze verdünnt, auf 37 ° C vorgewärmt, mit 10% v / v Perlensuspension (entweder Adhäsin-gekoppelten Kügelchen oder Kontrollkügelchen), zu einer MOI von 10. Bereiten Sie 1 ml geben / gut, und 10-20% Überschussvolumen pro Probe. Anmerkung: Bei den oben genannten Bedingungen (24-Well-Platte, V. parahaemolyticus, MOI 10), das notwendige Volumen des O / N-Kultur zu je Vertiefung (ml / ml) ist als 3 / OD 600 der Kultur Höhe berechnet. Zum Beispiel wird 1 ml Infektionsmedium enthält typischerweise 100 ml Partikelsuspension, ein paar ml Bakterienkultur und bis zu 1 ml mit farblosen, nicht ergänzten DMEM hergestellt werden. Entfernen alte Medium aus den Vertiefungen und waschen kultivierten HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml sterilem PBS vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Vertiefung. Entfernen PBS und 1 ml Infektionsmedium pro Vertiefung. Auch die Kontrollen eingestellt, durch Zugabe von Lösungen containing Steuer Perlen und Bakterien (positive Kontrolle) oder Adhäsin Perlen und keine Bakterien (negative Kontrollen) oder DMEM, das 0,1% Triton X-100 (Lyse-Steuerung, nur für Zytotoxizität Messungen erforderlich). Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für die gewünschte Zeitdauer (zB 4 Stunden auf Cytotoxizität Messungen oder 1 Stunde auf Haftung Messungen). Anmerkung: sind bakterielle Adhäsion und Zytotoxizität auf Wirtszellen können als Auslesungen für die Wirksamkeit der Hemmung verwendet werden. Wenn die Zeitpunkte der Zytotoxizität und Haftungsmessungen übereinstimmen, können beide Tests durchgeführt unter Verwendung von Proben aus der gleichen gut, da Zytotoxizität wird mit dem Kulturüberstand und Befestigungs Assays verwenden Proben aus der restlichen Zellschicht abgeleitet wird, bestimmt. Zytotoxizität Messungen: Zu angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Stunden nach der Infektion), entfernen Sie dreimal 200 ml von jedem 24-Loch und Transfer zumeine 96-Well-Platte. Spin 96-Well-Platten bei 1500 × g, 5 min und Transfer 100 ml aus jeder Vertiefung in ein frisches 96-Well-Platte. 100 ml der bei der Infektionsexperimente Frisch Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung verwendeten Medien (diese werden als Rohlinge verwendet werden). Durchführung der Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest unter Verwendung eines LDH Zytotoxizität Nachweiskits und nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, die Berechnung der Menge an Reagenz in Schritten von 25 benötigt (zB wenn 62 Proben gemessen werden sollen, machen genug Reagenz-Mix für 75 etc.). Zum Beispiel für 100 Proben, mischen 11,25 ml Reagenz A mit 250 ul Reagenz B. umkehren, nicht vortexen Schaumbildung zu vermeiden. Setzen Sie die Mischung in einem Behälter in der Lage sein, mit einer Mehrkanal-Pipette pipettiert werden. 100 l Reagenzienmix zu jeder Probe. Inkubieren Platte bei RT und die Extinktion bei 490 nm auf einem Plattenleser bei 10, 20, 30 min. </li> Analysieren des Datensatzes, für die die Absorption der Lyse Kontrollprobe hoch ist, aber immer noch innerhalb des linearen Bereichs des Plattenlesers (typischerweise 2-3 Extinktionseinheiten). Express-Ergebnisse als% Zytotoxizität, nach der folgenden Formel für die Umrechnung: Die Messung der bakteriellen Adhäsion: Bei den angegebenen Zeitpunkten (beispielsweise 1 Stunde nach der Infektion), das Medium entfernt, der Zellschicht. Die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmten PBS (mindestens 3-4 Wäschen von jeweils 1 ml PBS), um alle nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. Lyse von Wirtszellen durch Zugabe von 1 ml einer sterilen 1% v / v Triton X-100-Lösung in PBS pro Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 min. Pipettieren Sie jede Probe nach oben und unten mehrere Male, bevor die Übertragung der Inhalt der Vertiefungen bis 1,5-ml-Röhrchen zu trennen. Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen von Probenin sterile PBS (zB verwenden 100 ml Probe und 900 ml PBS). Platte 100 ml von jeder Probe auf MLB Agar und verteilt unter Verwendung einer Zelle Treuer. Optimieren Sie die je nach Bakterienstämme und Zeitpunkt bis zum Teller Verdünnung. Hinweis: Für die beschriebenen Versuchsaufbau, geben 10 5 oder 10 6 fachen Verdünnungen eine geeignete Anzahl von KBE. Platten bei 37 ° CO / N und aufzuzählen Bakterien durch Koloniezählung.