Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

1. chimique Couplage de protéines à des billes de polymère Couplage directionnel thiol-amine Remarque: Ce protocole est adapté pour coupler des protéines à cysteine ​​contenant à fonction amine perles de polymère, en utilisant sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyrate (SMPB Sulfo-) comme agent de réticulation (Figure 1). Figure 1. réticulation stratégie utilisée pour directionnelle couplage thiol-amine de protéines à des billes de polymère. Billes de polystyrène Amine modifiés sont activés avec Sulfo-SMPB. Le maléimide réagit avec cystéines libres à directionnellement protéines couple à billes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Préparation des réactifs: Préparer PBS (phosphate de sodium 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) et autoclave. </li> Préparer un stock 100x (0,5 M ou 287 mg / ml dans PBS) du PTCE (tris (2-carboxyéthyl) phosphine) immédiatement avant utilisation. Préparer un 5x stock (10 mM ou 4,58 mg / ml dans dH 2 O) de Sulfo-SMPB immédiatement avant l'utilisation. Préparer un 10x stock (500 mM ou 88 mg / ml dans du PBS, pH 7,0) de la cystéine, immédiatement avant utilisation. Activation Perle: Mélanger la suspension de billes en retournant doucement et transférer la quantité requise de la suspension de billes (par exemple, 12 ml) dans un tube stérile de 1,5 ml contenant 1 ml de PBS stérile, pH 7,0. Pipette doucement monter et descendre pour laver les perles et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse (2 min à 16 000 xg). Retirer délicatement le surnageant avec une pipette et défausse. Reprendre le culot de billes dans 1 ml de PBS stérile frais et répéter l'étape de lavage. Reprendre le culot de billes dans 0,8 ml de PBS. Ajouter 200 ml de 10 mM fraîchement préparée Sulfo-SMPB, pour donner une concent finaleration de 2 mM. Incuber la suspension de billes pendant 1 heure à 25 ° C sur une roue en rotation. La réduction de la protéine: Au cours de la période d'incubation de l'étape d'activation, pour préparer la protéine de l'étape de couplage suivante de sorte qu'il peut être immédiatement ajouté aux billes activées. Remarque: Bien que cette étape de réduction est pas toujours nécessaire pour GST (Glutathion S-transférase) des protéines de fusion, il est recommandé d'assurer une efficacité élevée de couplage. Vérifier la concentration en protéines, et de l'ajuster à la concentration finale requise pour la réaction de couplage. Remarque: 6 mM de protéine dans du PBS et un volume de 1 ml sont généralement utilisés. Ajouter PTCE mère pour donner une concentration finale de 5 mM. Incuber la solution pendant 30 min à température ambiante. Remarque: Le mélange de réaction peut être directement utilisé pour la réaction de couplage suivante. Maintenir une petite quantité (quelques ml) de la solution de protéine pour la détermination de la pro concentration protéine et le calcul du rendement de couplage (voir la section 2). Protéine accouplement étape: Pellet les billes activées par centrifugation (2 min, 16 000 x g dans une microcentrifugeuse), et laver le culot une fois dans 1 ml de PBS stérile frais. Reprendre le culot dans la solution de protéine préparée (par exemple, 1 ml), pour donner la concentration en protéines souhaitée. Remarque: La concentration de la protéine pendant l'étape de couplage dépendra de l'efficacité de couplage moyenne (voir la section 2 pour la détermination de l'efficacité de couplage) et de la densité de couplage désiré (tel que calculé à 1.1.4.3). Le rendement est d'environ 85%, et la concentration finale souhaitée dans le 5 mM 10x suspension de billes, de sorte que la concentration en protéines au cours de l'étape de couplage doit être d'environ 6 mM. Calculer la densité de couplage selon la formule suivante: jpg "/> où c ρ densité de couplage [nombre de molécules de protéines / nm 2], protéine concentration de protéine de conc [mg / ml], protéine M w poids moléculaire de protéine [Da], conc concentration bourrelet de talon [numéro de billes / L], diamètre d des billes [nm 2] Le nombre d'Avogadro Utilisez la densité de couplage pour calculer la distance de ligand moyenne: Incuber la suspension de protéine-billes pendant 2 heures à 25 ° C sur une roue en rotation. Remarque: Certainsprotéines ne peuvent pas être stable à température ambiante. Dans ces cas, la réaction peut être effectuée à 4 ° CO / N. Désactiver restants groupes activés sur les billes en ajoutant cystéine actions à une concentration finale de 50 mM et incuber la suspension pendant 30 min à 25 ° C sur une roue en rotation. Pellet les billes par centrifugation (2 min, 16 000 x g dans une microcentrifugeuse). Gardez le surnageant pour déterminer la concentration de protéines et de calcul du rendement de couplage (voir la section 2). Laver le culot de billes deux fois avec 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 1 ml de PBS frais pour donner le produit final. Remarque: Le protocole ci-dessus sera généralement donner 1 ml de protéine couplée, à une concentration finale de protéines 5 mm, ce qui peut être utilisé comme un stock 10x pour des expériences ultérieures (voir section 3). Pour procéder à l'article 3 du protocole, travailler avec 100 ml / ml de perles de stock, ou à une concentration finale de 500 nM de protéines. Remarque: Un bon point de départ pour cette procedure est de 2 × 10 12 / ml de perles, résultant en une densité de couplage de 3 x moyenne 10 -4 protéines / nm 2 ou un espacement moyen de 57 nm sur un cordon de 2 mm de diamètre. Couplage directionnel thiol-carboxy Remarque: Ce protocole est adapté pour coupler des protéines à cysteine ​​contenant des billes de polystyrène carboxyle fonctionnalisé. Le fragment carboxyle est d'abord activé à l'aide de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), l'aminé modifié et ensuite réticulé en utilisant Sulfo-SMPB (figure 2). Figure 2. réticulation stratégie utilisée pour directionnelle couplage thiol-carboxyle de protéines à des billes de polymère. Billes de polystyrène carboxylées sont d'abord activés avec EDC et modifiés avec NHS pour former un ester de NHS semi-stable. Après amine couplage de éthylènedirésultats amine dans un groupe amine libre qui réagit avec Sulfo-SMPB. Maléimide activé billes peuvent alors réagir avec cystéines libres à directionnellement protéines couple à billes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Préparation des réactifs: Préparer PBS (phosphate de sodium 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) et autoclave. Préparer un stock 100x (0,5 M ou 287 mg / ml dans du PBS,) du PTCE immédiatement avant utilisation. Préparer un stock 10x (20 mm ou 4 mg / ml dans PBS) d'EDC (1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) immédiatement avant utilisation. Préparer un stock 10x (50 mM, ou 6 mg / ml dans PBS) du NHS (N-hydroxysuccinimide) immédiatement avant l'utilisation. Préparer un 5x stock (10 mM ou 4,58 mg / ml dans dH 2 O) de Sulfo-SMPB immédiatement avant l'utilisation. Préparer un 10x stock (500 mM ou 88 mg / ml dans du PBS, pH 7,0) de la cystéine immédiatement bl'utilisation de vant. Activation Perle: Mélanger la suspension de billes en retournant doucement et transférer la quantité requise de billes en suspension (par exemple, 12 ml) dans un tube de 1,5 ml stérile contenant 1 ml de PBS stérile, pH 7,0. Pipette doucement monter et descendre pour laver les perles et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse (2 min à 16 000 xg). Retirer délicatement le surnageant avec une pipette et défausse. Reprendre le culot de billes dans 1 ml de PBS stérile frais et répéter l'étape de lavage. Reprendre le culot de billes dans 0,8 ml de PBS. Ajouter 100 ml de 10x EDC actions (2 mM concentration finale) et immédiatement 100 ml d'10x NHS solution stock (5 mM de concentration finale) de la suspension de billes. Incuber la suspension de billes pendant 30 minutes à 25 ° C sur une roue rotative. Lavez perles une fois dans 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 0,8 ml de PBS stérile frais. Ajouter 200 ml d'éthylènediamine, et incUbate la suspension de billes pendant 1 heure à 25 ° C sur une roue en rotation. Lavez perles une fois avec 1 ml de PBS et remettre en suspension les perles dans 0,8 ml de PBS frais. Procédez de la section 1.1.2.4 (activation de perle avec Sulfo-SMPB) comme décrit dans la section 1.1.2 et suivez le reste du protocole décrit dans la section 1.1 (couplage directionnel thiol-amine). Effectuer préparation de protéine et étapes de couplage de la protéine dans des conditions strictement identiques à celles décrites dans la section 1.1. Remarque: Le rendement de couplage typique utilisant ce protocole est légèrement inférieure par rapport à la section 1.1, donc régler la concentration de la protéine initiale en conséquence pour obtenir la même densité de couplage (à 75%.). 2. Détermination du rendement de couplage Remarque: Pour déterminer la concentration de protéines, utiliser Bradford Réactif 10 et essais colorimétriques comme suit: Retourner doucement Bradford réactif à l'e eiller homogénéité du réactif. Utilisation d'un / ml de solution de BSA 10 mg, d'élaborer des normes de protéines couvrant concentrations entre 0,1 et 1,5 mg / ml de BSA dans un tampon. Ajouter 250 ml de réactif de Bradford à des puits d'une plaque à 96 puits. Préparer suffisamment de puits pour tous les échantillons, les normes de protéines et des contrôles négatifs (tampon seulement). Ajouter 5 ml d'échantillon de protéine (étalons de protéine ou tampon, pour le témoin négatif) pour le réactif dans la plaque à 96 puits. Incuber la plaque sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 10 min. Mesurer l'absorbance à 595 nm en utilisant un lecteur de plaque. Générer une courbe standard de concentration BSA par rapport A595 nm et l'utiliser pour déterminer les concentrations de protéines dans les échantillons initiaux et un surnageant. Calculer la concentration de protéine couplée comme suit: Calculer le rendement de couplage en tant que: 00eq4.jpg "/> 3. Utilisation de Perle couplé adhésines en concurrence dosages Préparation: Graine de 1 ml par puits de cellules HeLa à une concentration de 150.000 cellules / ml dans une plaque de 24 puits la veille de l'essai de compétition, pour permettre aux cellules d'atteindre environ 80% de confluence avant de commencer l'expérience. Mettre en place chaque condition expérimentale en trois exemplaires. Inclure des puits pour les contrôles négatifs (pas de bactéries ajoutées au cours des essais de compétition), les contrôles positifs (perles de commande couplée à la fusion-tag seulement ajouté au cours des essais de compétition) et les contrôles de lyse (pour les expériences de cytotoxicité). Inoculer un LB (MLB) culture de 5 ml de marine avec une nouvelle colonie de V. parahaemolyticus et grandir O / N à 30 ° C, en secouant. Préparer MAM de perles couplé suffisante, comme décrit dans la section 1. (Coupling). Autoriser pour 100 ml de 10x perles de stock par puits. Analyse de la concurrence: Le jour de la competitexpérience d'ions, de mesurer l'OD 600 de la culture bactérienne. Préparer les médias de l'infection par dilution des cultures bactériennes dans DMEM incolore, sans additifs, pré-chauffé à 37 ° C, contenant 10% v / v la suspension de billes (soit adhésine couplé perles ou des perles de contrôle), pour donner une MOI de 10. Préparer 1 ml / puits et 10-20% volume excédentaire par échantillon. Note: Pour les conditions mentionnées ci-dessus (plaque de 24 puits, V. parahaemolyticus, MOI 10), le volume nécessaire de culture O / N être ajoutés par puits (ml / ml) est calculé comme 3 / OD 600 de la culture. Par exemple, 1 ml de milieu d'infection contiendra typiquement 100 ml suspension de billes, quelques ml de la culture bactérienne et être faite jusqu'à 1 ml avec incolore, DMEM non complété. Retirer ancien milieu des puits et laver les cellules HeLa cultivées en ajoutant 1 ml de PBS stérile préchauffée à 37 ° C pour chaque puits. Retirer du PBS et ajouter 1 ml de milieu d'infection par puits. Également mis en place des contrôles, en ajoutant des solutions suiteaining perles et les bactéries (contrôle positif) ou perles d'adhésine et aucune bactérie (contrôles négatifs), ou contrôle DMEM contenant 0,1% de Triton X-100 (contrôle, seulement nécessaire pour les mesures de cytotoxicité lyse). Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C pendant la durée souhaitée (par exemple de 4 heures pour des mesures de cytotoxicité ou 1 h pour les mesures d'adhérence). Note: les deux adhésion bactérienne et la cytotoxicité sur les cellules hôtes peuvent être utilisés comme-outs lire pour l'efficacité de l'inhibition. Si les points de temps de cytotoxicité et d'adhérence mesures coïncident, les deux dosages peuvent être réalisés en utilisant des échantillons à partir de la même source, étant donné que la cytotoxicité est déterminée en utilisant le surnageant de culture et de fixation des dosages utilisent des échantillons provenant de la couche de cellules restants. Des mesures de cytotoxicité: Aux points de temps indiquée (par exemple, post-infection de 4 heures), retirer trois fois 200 ml de chaque 24 puits et transfert àune plaque de 96 puits. Spin plaques à 96 puits à 1500 xg, 5 min et de transfert de 100 ml de chaque puits dans une plaque de 96 puits fraîche. Ajouter 100 ml de médias utilisés lors de l'infection expériences aux puits fraîches de la plaque de 96 puits en trois exemplaires (ceux-ci seront utilisés comme des blancs). Effectuer le test déshydrogénase (LDH) de libération de lactate en utilisant un kit de détection de cytotoxicité LDH et en suivant les instructions du fabricant. Brièvement, calculer la quantité de réactif nécessaire par incréments de 25 (par exemple, si 62 échantillons doivent être mesurés, faire assez mélange de réactifs pour 75 etc.). Par exemple, pour 100 échantillons, mélanger 11,25 ml de réactif A avec 250 pi de réactif B. Inverser, ne pas vortexer afin d'éviter la formation de mousse. Placez le mélange dans un réservoir pour être en mesure de pipeter avec une pipette à canaux multiples. Ajouter 100 ul de mélange de réactifs à chaque échantillon. Incuber la plaque à température ambiante et de lire l'absorbance à 490 nm sur un lecteur de plaque à 10, 20, 30 min. </li> Analyser l'ensemble de données pour lequel l'absorbance de l'échantillon de contrôle de lyse est élevé, mais toujours dans la gamme linéaire du lecteur de plaque (typiquement, 2-3 unités d'absorbance). Exprimer les résultats en% cytotoxicité, en utilisant la formule suivante pour la conversion: Mesure de l'adhésion bactérienne: Aux points de temps indiquée (par exemple, post-infection de 1 h), retirer le support de la couche cellulaire. Bien laver la couche cellulaire avec stérile, PBS préchauffé (au moins 3-4 lavages de 1 ml de PBS chacun) pour éliminer toutes les cellules de l'ONU-joint. Lyse des cellules hôtes par l'ajout de 1 ml d'une solution stérile 1% v / v de Triton X-100 solution dans du PBS par puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min. Introduire à la pipette chaque échantillon monter et descendre plusieurs fois avant de transférer le contenu de chaque puits pour séparer tubes de 1,5 ml. Préparer 10 fois des dilutions en série d'échantillonsdans PBS stérile (par exemple, utiliser 100 ml d'échantillon et 900 ml de PBS). Plaque 100 ml de chaque échantillon sur gélose MLB et la propagation à l'aide d'un épandeur de cellule. Optimiser qui dilutions à l'assiette en fonction des souches bactériennes et point de temps. Remarque: Pour le montage expérimental décrit, 10 5 ou 10 6 dilutions de pliage donnent un nombre approprié de CFU. Incuber les plaques à 37 ° CO / N et dénombrer les bactéries par comptage de colonies.