İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

BOEC kuşak protokolünün şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir. 1. Kan Toplama ve Yoğunluk Gradient Santrifüj Her bir donör, iki 50 ml konik santrifüj tüpleri her sodyum sitrat 3 ilave edin. Damar delme ile kan 60 ml toplamak ve her tüpe 30 ml ekleyin. Karıştırmak için hafifçe 2-3 kez ters çevirin. Buna göre ayarlanır sitrat hacimli, protokol kan az 40 kadar ml kullanın. NOT: Bu kan örnekleri alındıktan sonraki 2 saat içinde işlenir esastır. Outgrowth koloni verim belirgin bir azalma kan sonuçlarının işlenmesi Gecikmeli. İlk şişeyi karıştırmak için birkaç kez ters çevirerek yoğunluk gradyan santrifüj ortamı içeren yeni konik tüpler hazırlayın. Steril bir başlık olarak, 50 ml konik bir tüp başı (kan, her 10 ml donör başına 6 tüp 1 tüp) yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamının 15 ilave edin. Dulbecco'nun Fosfat ile 1: 1 seyreltin kan-buffered Salin (DPBS). Çalışma yüzeyi ile 20 ° 'lik bir açıya yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamı içeren tüp yatırın. Bir pipet yardımı ve 25 mi serolojik pipet kullanarak, yavaş yavaş yavaş eğimli borunun duvar aşağı kan eklenerek ortam üzerine seyreltilmiş kan 21 ml katman. NOT: Aksi takdirde yoğunluk gradyan tabaka ile kan karışmasını en aza indirir ve daha sıkı buffy coat, hem de artan bir verimdeki üretecektir. 35 hızlandırıcı ile oda sıcaklığında dakika ve fren kapalı 400 xg'de Santrifüj örnekleri. 2.4 – Bu santrifüj döneminde adımlar 2.1 detaylandırılan kollajen kaplama başlar. Bu adımlar 3.1 adıma geçmeden önce tamamlanmıştır olun. T-75 balonuna ve kültür besiyeri Preparasyon 2. Kolajen Kaplama NOT: Bir hücre kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. Stok Ty seyrelterek bir 50 ug / ml kolajen çözeltisi hazırlayın. I 0.02M asetik asit Örnek 10 ml kolajen pe: kolajen stok için 4.05 mg / ml konsantrasyonda, 0.02 M asetik asit 10 ml kolajen 123.5 uL ekleyin. Steril filtre kollajen süspansiyonu, kullanımdan önce. Serolojik bir pipet kullanarak, bir T 75 hücre kültürü şişesine kolajen çözeltisi 7,5 ml ekleyin. Bu hacim 5 ug kollajen / cm 2 (veya 375 ug / şişesi) verir. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile kaplayın şişe. Üretici tarafından sağlanan büyüme faktörü takviyeleri ile endotel bazal ortamı ilave ile BOEC üretimi için kullanılan endotelyal büyüme ortamı hazırlayın. Tüm takviyeleri ekleyin, ancak serum ilave etmeyiniz. , BOEC üretim ortamının 15 ml hazırlamak büyüme faktörü eklemeleri içeren endotelyal büyüme ortamı, 12.5 ml tanımlanır fetal sığır serumu (FBS), 2.5 ml ekleyin. , 1 saat kaplama süresinden sonra Bölüm 3'te belirtilen adımlara devam kollajen çözüm aspirat ve pipetleme kalan asetik asit silsin10 ml DPBS. DPBS kapalı aspire ve bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın. Aşama 3.3 sırasında elde edilen hücre süspansiyonu, şu anda kaplama hazır değilse, kurutma-out kolajen kaplama tutmak için şişeye BOEC üretim ortamının 5 mL ekleyin. 3. Toplama ve PBMNCs ve Kaplama Aşama 1.4'te tarif yoğunluk gradyan santrifüjü takiben, dikkatli bir şekilde, steril plastik bir transfer pipeti kullanarak, ince beyaz tabaka faz toplanır. Buffy coat toplanması her tüpten hücre süspansiyonu ve plazma yaklaşık 20 ml vermelidir. Yoğunluk gradyan ortamı transfer kaçının. Mononükleer hücre süspansiyonu 1 seyreltilir: DPBS'de 1 ve karıştırmak için ters. Maksimum fren ile gaz pedalı 300 x g'de 20 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, basılı art arda her bir topağa BOEC üretim ortamı, 1 ml ilave edilmesi ve yukarı ve aşağı pipetleme süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Havuz hücresi bir süspansiyonlarıKalan ortamı ile 10 ml d kontör toplam hacim. Toplam hücre sayısı, örnek hücre süspansiyonu 10 ul bir tahmin almak ve kırmızı kan hücreleri lyse olacak Türk'ün solüsyonu 490 ul ile 50x sulandırmak için. Bir hemositometre kullanılarak seyreltilmiştir hücre süspansiyonu, 10 ul numune sayısı. NOT: Kan 60ml kaplama için yaklaşık 100-150 x 10 6 beyaz kan hücrelerini boyun eğmek zorundadır. Tek bir kollajen kaplı T-75 balon içine Plaka tüm hücre süspansiyonu,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C 'de 15 mL / şişe ve kültür üst kadar orta hacimli. Bu anda kaplama hücreler pasaj 0 temsil etmektedir. Not: Bu, daha sonraki bir zamanda veya BOECs oluşturulabilir farklı laboratuara PBMNCs taşımak amacıyla BOECs elde etmek amacıyla, önceki BOEC izolasyon izole PBMNCs dondurmak mümkündür. Bununla birlikte, bu dondurma PBMNCs BOEC izolasyonun etkinliğini azaltabilir dikkat etmek önemlidir. Syöntemi için aşağıdaki ee bölüm 8. 4. Uzun süreli Hücre Kültürü Taze BOEC üretim ortamının 15 ml ekleyerek ortam her 2 günde değiştirme (5: endotelial hücre büyüme ortamı 1 karışımına FBS tanımlanır). Hafta sonları için, orta değişiklikler her 3 gün gecikebilir. NOT: akıbet koloniler kültür 7 ve 14 gün arasında görünmelidir. Akıbet kolonilerin görünümü için gün 7-14 BOEC kültür şişesi izleyin. Klasik endotel Arnavut kaldırımı morfolojisi sergileyen hücreler dairesel grupları gibi koloniler tanımlayın. Koloni ya da çoklu koloniler bir şişe içinde tespit edildikten sonra, ortam değişiklikleri ile devam eder ve koloniler pasajlarının önce koloni başına yaklaşık 1000 2.000 hücrelere büyümeye olanak sağlar. Kaba bir görsel tahmin ile koloni başına hücre sayısını belirler. NOT: Bir rehber olarak, bir hafta birinci akıbet kolonisinin tanımlanmasından sonra geçit ilk akıbet kolonileri adettendir. <li> DPBS 10 ml ile iki kez durulama ile şişeler Geçiş hücreleri. 1X Tripsin-EDTA 5 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. 5 dakika sonra, ortam (FBS ihtiva eden) 10 ml tripsin nötralize etmek ve tekrar pipetleme ile süspansiyon haline hücreleri getir. 5 dakika boyunca 300 x g'de, taze BOEC üretim ortamının 15 ml tekrar süspansiyon ve yeni bir T-75 balonuna (temsil kanalı 1, P1) içine tüm bir hücre süspansiyonu plaka santrifüjleyin süspansiyon. Hiçbir kollajen kaplama gereklidir. Hücreler birleştiklerinde, (kap başına yaklaşık 3-5 x 10 6 hücre) kadar yukarıda tarif edildiği gibi orta değişiklikler devam edin. Birleşmiş sonra, geçit hücreleri adım 4.3 de tarif edildiği gibi. Not: itibaren geçit 2, hücreler artık BOEC nesil orta gerektirir ve endotel hücre büyüme ortamı ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş, standart FBS içinde kültürlenebilir. Kollajen varlığı BOEC prolifer artırabilirsiniz olduğunu gösteren kanıtlar var gibi Kollajen kaplama, isteğe bağlı bir adım ileri gidiyor olarak kullanılabilirtirme oranları. Devam Pasajlanması, plaka T-75 balonuna başına hiçbir az 750.000 den hücreleri için düşük hücre yoğunlukları BOECs çoğalan durmasına neden olabilir. 5. Donma ve Çözülme BOEC Kültürleri 5 dakika boyunca 300 xg'de bölüm 4.3 ve santrifüj açıklandığı gibi hücreleri Trypsinize. Ortam, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Bu endotelial hücre büyüme ortamı gerektirmez; 10%, standart FBS bulunan DMEM yeterli olacaktır. Bir hemositometre kullanılarak el ile hücre sayımı gerçekleştirmek için hücre süspansiyonu, 10 ul numune toplayın. Buz soğukluğunda kriyoprezervasyon ortamında (% 50 FBS ve% 10 DMSO ile% 40 DMEM) 'de 2×10 6 hücre / ml'de tekrar santrifüj ve süspansiyon haline getirin. Bir buz soğuk izopropanol dondurulması gemi ve yerinde 0.5 ml (10 6 hücre) her şişeye, yer şişeleri ekle -80, en az 2 saat ° C derin dondurucuda sıvı nitrojen aktarmadan önce. Birden fazla 24 saat boyunca -80 ° C 'de hücreler bırakma. </li> Hücreler çözülme 15 ml konik santrifüj tüpüne önceden ısıtılmış ortam 10 ml ekleyin. NOT: pasajı 1 hücreleri çözdürme zaman çözdürme sonrası ilk 2 gün FBS tanımlanmış% 20 ile desteklenmiş endotel hücre büyüme ortamına çözülme. Bu daha kararlı bir hücre izolasyonu ileriye yol açar. Sadece küçük bir buz kristali şişe içinde kalana kadar hafif bir çalkalama ile 37 ° C su banyosu içinde, sıvı azot ve çözülme hücreleri çıkarın. Konik santrifüj tüpüne flakon damla damla içeriğini ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 xg'de aşağı doğru döndürün. 10 ml EGM-2mV +% 10 FBS içinde Süpernatant aspire ve tekrar süspansiyon hücre pelet. 15 ml T-75 şişesi ve kontör orta ekleyin. Akış Sitometrisi ile BOECs 6. Karakterizasyonu Lekeleme tampon maddesi içinde ml başına 10 6 hücre konsantrasyonunda bölüm 4.4 ve tekrar süspansiyon tarif edildiği gibi, Bölüm 4'te tarif BOEC koloniler trypsinize hücreleri genişletmek için izin verilmiş sonra (DPBS with% 2 FBS ve 2 mM EDTA). CD45, CD14, CD34, CD31 (kullanım 01:20 seyreltme tüm) veya VEGFR2 (sulandırmak 01:10) yöneltilen florokrom-konjuge antikor (detaylar için bakınız Tablo 1) ile 10 5 hücreleri birleştir. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın. 1 ml 5 dakika boyunca 300 xg'de tampon ve santrifüj boyama hücreleri yıkayın. Süpernatant aspire ve analiz için 400 ul tampon boyama tekrar süspansiyon. 4 ° C'de tutun hücreleri ve ışıktan analizden önce korunmaktadır. Deneyde kullanılan floresan konjuge antikorları tespit etmek için donatılmış bir sitometresindeki sitometrik analizi yapın. İleri ayarlama ve yan dağılım gerilimleri yanı sıra FITC ve APC kanallar için gerilimler tarafından sitometresindeki hücre popülasyonunu belirlemek için bir lekesiz BOEC örneği kullanın. Her florokrom için izotip lekeli hücreleri kullanarak eşik yolluk belirleyin. Presenc dayalı olarak her bir hücre yüzey markörü için pozitif değerlendirilmesiflorokrom için izotip kontrol grubuna kıyasla flüoresans yoğunluğunda bir pik kayması e analiz edilir. Immunofluorescent Mikroskopi BOECs 7. Karakterizasyonu Endotelial hücre büyüme ortamı 500 ul 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda lamelleri olmadan 24 oyuklu düz dipli doku kültür plakasında Plaka BOECs +% 10 ısı ile inaktive edilmiş oyuk başına FBS ve bağlı ve 37 ° C'de büyümeye bırakın ° C, hücreler kadar% 5 CO2, en az 70-80, her yüzey alanının% de (hafif microsope altında görsel inceleme ile tahmini konfluent) kapsamaktadır. DPBS 1 ml 5 dakika boyunca her bir hücrelerin yıkayın. DPBS içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi 500 ul 4 ° C 'de hücreler O / N sabitleyin. Oyuk başına DPBS 1 ml 3 x 5 dakika boyunca hücreler yıkanır. Ekleyin ve sırasıyla bir pipet ve bir aspiratör kullanarak DPBS kaldırmak. DPBS içinde% 0.2 polisorbat 20, 3 x 10 dakika boyunca hücreler geçirgenliği. </li> DPBS içinde% 10 FBS içeren bloke edici tampon içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe hücreleri. 4 ° CO de leke hücreleri antikor seyreltme tamponu CD34 (10 ug / ml), CD144 karşı birincil antikor ihtiva eden (DPBS içinde% 0.1 sığır serum albümini) içinde 300 ul / N (1: 300) ya da vWF (1: 250) . Tüm ayrıntılar için Tablo 1'e bakınız. DPBS ile 5 x 10 dakika boyunca, bağlanmamış birincil antikor yıkayın. (: 200, 1 hiç) Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe hücreleri. DPBS ile 5 x 10 dakika boyunca Bağlanmamış ikinci antikorları yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol 1 ug (DAPI) ile hücrelerin inkübe edin. Bir başka 3 x 5 dakika boyunca DPBS ile hücrelerin yıkayın. Bir takmak kullanarak floresan uyarma için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış ters bir mikroskop kullanılarak 100x büyütmede görüntü hücreleri ve yakalama görüntülerisonraki analiz çevrimdışı için ed dijital fotoğraf makinesi. 8. Donma ve Çözülme PBMNCs Santrifüj sonraki aşamada 3.2 sonunda, orta aspire ve manuel tekrarlanan pipetle kadar olan ve bir P1000 pipet kullanarak aşağı hücre pelet bozabilir. Bir hücre süspansiyonu üretmek için hafifçe karıştırın emin olarak, dondurma ortamı,% 90 serum ve% 10 DMSO 1 ml ilave edilir. Bir cryovial hücre süspansiyonu aktarın ve dondurma ve Bölüm 5'te açıklandığı gibi çözülme.