Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

A esquemática del protocolo de generación BOEC se muestra en la Figura 1. 1. Extracción de Sangre y gradiente de densidad de centrifugación Para cada donante, añadir 3 ml de citrato de sodio a cada uno de dos tubos de centrífuga de 50 ml cónicos. Recoger 60 ml de sangre por punción venosa y añadir 30 ml a cada tubo. Invierta suavemente 2-3 veces para mezclar. Utilice tan sólo 40 ml de sangre en el protocolo, con volúmenes de citrato ajustados en consecuencia. NOTA: Es esencial que las muestras de sangre se procesan dentro de 2 horas de la recolección. Retraso en el procesamiento de los resultados de sangre en una marcada reducción en el rendimiento colonia consecuencia. Preparar nuevos tubos cónicos que contienen medio de centrifugación en gradiente de densidad por primera invirtiendo el frasco varias veces para mezclar. En una campana estéril, añadir 15 ml de medio de centrifugación en gradiente de densidad por cada 50 ml tubo cónico (1 tubo por cada 10 ml de sangre, 6 tubos por donante). Diluir la sangre 1: 1 con fosfato de DulbeccoSaline -Buffered (DPBS). Incline el tubo que contiene el medio de centrifugación en gradiente de densidad a un ángulo de 20 ° con la superficie de trabajo. El uso de una ayuda de la pipeta y una pipeta serológica de 25 ml, la capa lentamente 21 ml de sangre diluida en la parte superior del medio mediante la adición gradual de sangre por la pared del tubo inclinado. NOTA: Si lo hace, minimizar la mezcla de la sangre con la capa de gradiente de densidad y producirá una capa leucocitaria más apretado, así como un rendimiento mejorado. Centrifugar las muestras a 400 xg durante 35 min a TA con el acelerador y el freno. Durante este período de centrifugación, comenzará el recubrimiento de colágeno se detalla en los pasos 2.1 – 2.4. Asegúrese de que estos pasos se han completado antes de proceder al paso 3.1. 2. El colágeno Recubrimiento de T-75 Frasco y Preparación del medio de cultivo NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo celular. Preparar una solución de colágeno / ml 50 mg diluyendo Stock TyPE I colágeno en 10 ml de ácido acético 0,02 M Ejemplo:. para el colágeno de stock a una concentración de 4,05 mg / ml, añadir 123,5 l de colágeno a 10 ml de ácido acético 0,02 M. Filtro estéril suspensión de colágeno antes de su uso. Utilizando una pipeta serológica, añadir 7,5 ml de solución de colágeno a un matraz de cultivo de células T-75. Este volumen da 5 mg de colágeno / cm2 (o 375 mg / frasco). Escudo matraz durante 1 hora a RT. Preparar el medio de crecimiento endotelial utilizado para la generación BOEC completándolo medio basal endotelial con los suplementos de factores de crecimiento proporcionadas por el fabricante. Añadir todos los suplementos, pero no agregue suero. Para preparar 15 ml de medio de generación BOEC, añadir 2,5 ml de suero bovino fetal definido (FBS) a 12,5 ml de medio de crecimiento endotelial que contiene los suplementos de factores de crecimiento. Continúe con los pasos descritos en la sección 3. Después del período de recubrimiento 1 hr, aspirar la solución de colágeno y lava el ácido acético residual mediante pipeteoen 10 ml de DPBS. Aspirar el DPBS y repita este paso de lavado una vez más. Si la suspensión celular obtenida durante el paso 3.3 no está listo para el recubrimiento en este momento, añadir 5 ml de medio de generación BOEC al matraz para mantener el revestimiento de colágeno a partir de secado-out. 3. Recogida y Chapado de PBMNCs Después de la centrifugación en gradiente de densidad se indica en el paso 1.4, recoger cuidadosamente la capa leucocitaria usando una pipeta de transferencia de plástico estéril. Colección de la capa leucocitaria debe producir aproximadamente 20 ml de suspensión de células y plasma de cada tubo. Evitar la transferencia de el medio de gradiente de densidad. Diluir la suspensión de células mononucleares 1: 1 en DPBS e invierta para mezclar. Centrifugar a TA durante 20 min a 300 xg con freno y acelerador al máximo. Después de la centrifugación, aspirar las células sobrenadante y resuspender mediante la adición de 1 ml de medio de generación BOEC a cada pellet y pipeteando arriba y abajo varias veces. Celular piscina suspensiones und reponer volumen total de 10 ml con el medio restante. Para obtener una estimación del número total de células, muestra de 10 l de suspensión celular y se diluye 50x con 490 l de solución de Turk, que se lisar células rojas de la sangre. Contar una muestra de 10 l de la suspensión celular diluida usando un hemocitómetro. NOTA: 60 ml de sangre debe producir aproximadamente 100 a 150 x 10 6 células blancas de la sangre para la siembra. Placa suspensión celular entera en una sola, T-75 frasco de colágeno recubierto, top-up volumen medio a 15 ml / frasco y la cultura a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. Las células chapados en este momento representan el paso 0. NOTA: Es posible congelar las PBMNCs aislados antes del aislamiento BOEC con el fin de derivar las BOECs en un momento posterior o con el fin de transportar los PBMNCs a un laboratorio diferente, donde los BOECs se pueden generar. Sin embargo, es importante señalar que PBMNCs congelación podrían reducir la eficiencia de aislamiento BOEC. See sección 8 a continuación para el método. Cultivo Celular 4. A largo plazo Cambio de medio cada 2 días mediante la adición de 15 ml de medio de generación BOEC fresco (5: 1 mezcla de medio de crecimiento de células endoteliales y definido FBS). Para fines de semana, cambios de medio pueden retrasarse a cada 3 días. NOTA: colonias consecuencia deben aparecer entre los 7 y 14 días de cultivo. Supervisar el frasco de cultivo BOEC en los días 7-14 de la aparición de colonias excrecencia. Identificar las colonias como grupos circulares de células que presentan un clásico morfología de adoquines endotelial. Una vez que una colonia o múltiples colonias se identifican en el matraz, continúe con cambios de medio y permitir que las colonias crezcan hasta aproximadamente 1.000 a 2.000 células por colonia antes de pases. Determinar el número de células por colonia a través de una estimación visual aproximada. NOTA: Como guía, se acostumbra a paso colonias excrecencia iniciales Una semana después de la identificación de la primera colonia consecuencia. <li> células paso por aclarado matraces dos veces con 10 ml de DPBS. Añadir 5 ml de 1X tripsina-EDTA y se incuban en una incubadora a 37 ° C durante 5 min. Después de 5 min, neutralizar la tripsina con 10 ml de medio (que contiene FBS) y llevar las células en suspensión con pipeteo repetido. Suspensión Centrifugar a 300 xg durante 5 min, se resuspende en 15 ml de medio fresco y generación BOEC placa entera suspensión celular a un nuevo matraz T-75 (que representa el paso 1, P1). No se requiere ningún recubrimiento de colágeno. Continuar cambios de medio como se describe más arriba hasta que las células son confluentes (aproximadamente 3-5 x 10 6 células por frasco). Una vez confluentes, las células de paso como se ha descrito en el paso 4.3. NOTA: Desde el paso 2 en adelante, las células ya no requieren la generación de medio BOEC y puede ser cultivado en un medio de crecimiento de células endoteliales y 10% estándar FBS inactivado por calor. Revestimiento de colágeno puede ser utilizado como un paso opcional en el futuro, ya que no hay evidencia que sugiere que la presencia de colágeno puede mejorar prolifer BOEClas tasas de inflación. Para pases continuación, la placa no menos de 750.000 células por matraz T-75 como bajas densidades celulares pueden causar los BOECs para detener la proliferación. 5. La congelación y descongelación Culturas BOEC Trypsinize células como se describe en la sección 4.3 y se centrifuga a 300 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de medio. Esto no requiere un medio de crecimiento de células endoteliales; DMEM con 10% FBS estándar será suficiente. Recoger una muestra de 10 l de la suspensión de células para llevar a cabo un recuento de células manual utilizando un hemocitómetro. Centrifugar de nuevo y resuspender en 2×10 6 células / ml en medio de criopreservación enfriado con hielo (40% de DMEM con 50% de FBS y 10% de DMSO). Añadir 0,5 ml (10 6 células) a cada vial, lugar viales en un hielo isopropanol frío recipiente de crioconservación y colocar en un congelador a -80ºC durante al menos 2 horas antes de transferir a nitrógeno líquido. No deje las células a -80 ° C durante más de 24 horas. </li> Para descongelar las células, añadir 10 ml de medio precalentado a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml. NOTA: Al descongelar a cabo el paso 1 células, descongelar en un medio de crecimiento de células endoteliales suplementado con 20% FBS definido por los primeros 2 días después de la descongelación. Esto conduce a un aislamiento de células más estable en el futuro. Extraer células del nitrógeno líquido y descongelación en un 37 ° C baño de agua con agitación suave hasta que sólo un pequeño cristal de hielo se deja en el vial. Añadir el contenido del vial gota a gota al tubo de centrífuga cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de EGM-2MV + 10% de FBS. Añadir a T-75 frasco y medio superior hasta 15 ml. 6. Caracterización de BOECs por Citometría de Flujo Una vez que las colonias BOEC descritos en la sección 4 se les ha permitido ampliar, trypsinize células como se describe en la sección 4.4 y resuspender en una concentración de 10 6 células por ml en tampón de tinción (DPBS ingenioh 2% de FBS y EDTA 2 mM). Combine 10 5 células con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra CD45, CD14, CD34, CD31 (uso todos a la dilución 1:20) o VEGFR2 (diluir 1:10) (ver Tabla 1 para más detalles). Incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad. Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Sobrenadante Aspirar y resuspender en 400 l de tampón de tinción para el análisis. Mantenga las células a 4 ° C y protegido de la luz antes del análisis. Realizar análisis de citometría de un citómetro equipada en detectar los anticuerpos conjugados con fluorescencia utilizados en el ensayo. Utilice una muestra BOEC sin teñir para identificar la población de células en el citómetro mediante el ajuste hacia delante y voltajes de dispersión lateral, así como los voltajes para los canales de FITC y APC. Determinar gating umbrales utilizando células isotipo manchado para cada fluorocromo. Evaluar positividad para cada marcador de superficie celular basado en la presencestá analizando e de un cambio máximo en la intensidad de fluorescencia frente al control de isotipo para el fluorocromo. 7. Caracterización de BOECs por Microscopía de inmunofluorescencia BOECs placa en una pocillos 24, placa de cultivo tisular de fondo plano sin cubreobjetos a una densidad de 5 x 10 4 células en 500 l de medio de crecimiento de células endoteliales + 10% de FBS por pocillo y se dejó a adherirse y crecer a 37 inactivado por calor ° C, 5% de CO 2 hasta que las células cubrir al menos el 70-80% de la superficie de cada pocillo (estimación de confluencia mediante inspección visual bajo un Microscopio de luz). Lavar las células en cada pocillo durante 5 min con 1 ml de DPBS. Fijar las células O / N a 4 ° C con 500 l de solución de paraformaldehído al 4% en DPBS. Lavar las células de 3 x 5 min con 1 ml de DPBS por pocillo. Añadir y eliminar los DPBS utilizando una pipeta y un aspirador, respectivamente. Permeabilizar las células para 3 x 10 min con 0,2% de polisorbato 20 en DPBS. </li> Se incuban las células durante 1 hora a RT en tampón de bloqueo que contiene 10% de FBS en DPBS. Células de la mancha a 4 ° CO / N en 300 l de tampón de dilución de anticuerpo (0,1% de albúmina de suero bovino en DPBS) que contiene anticuerpos primarios dirigidos contra CD34 (10 mg / ml), CD144 (1: 300) o vWF (1: 250) . Ver Tabla 1 para más detalles. Lavar anticuerpos primarios no consolidados para 5 x 10 min con DPBS. Se incuban las células durante 1 hora a RT con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia apropiada, como se detalla en la Tabla 1 (todos a 1: 200). Lavar secundaria de anticuerpos no unidos para 5 x 10 min con DPBS. Se incuban las células con 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en DPBS durante 10 min a RT. Lavar las células con DPBS durante otros 3 x 5 min. Celdas de imagen a 100 aumentos utilizando un microscopio invertido equipado con una fuente de luz externa para la excitación de fluorescencia, y capturar imágenes utilizando un adjuntarcámara digital ed para su posterior análisis fuera de línea. 8. congelación y descongelación PBMNCs Al final de la etapa 3.2, después de la centrifugación, aspirar el medio y alterar manualmente el sedimento celular con repetido pipeteado arriba y hacia abajo utilizando una punta de pipeta P1000. Añadir 1 ml de medio de congelación, 90% de suero y 10% de DMSO, asegurándose de mezclar suavemente para producir una suspensión celular. Transferir la suspensión celular a un criovial y congelar y descongelar como se describe en la Sección 5.