Поколение и культура крови вырост эндотелиальных клеток из периферической крови человека

Схема протокола BOEC поколения показана на рисунке 1. 1. Кровь Сбор и центрифугирования в градиенте плотности Для каждого донора, добавить 3 мл раствора цитрата натрия к каждому из двух конических 50 мл центрифужные пробирки. Сбор 60 мл крови из вены и добавить 30 мл в каждую пробирку. Обратить мягко 2-3 раза перемешать. Используйте как 40 мл крови в протоколе, с объемами цитрат соответствующим образом скорректированы. Примечание: Очень важно, чтобы образцы крови обрабатываются в течение 2 ч сбора. Задержка обработки результатов крови в существенному сокращению в вырост выход колоний. Подготовка новых конические пробирки, содержащие центрифугирования в градиенте плотности среды сначала перевернув бутыль несколько раз перемешать. В стерильных капот, добавьте 15 мл центрифугированием в градиенте плотности среды в 50 мл коническую пробирку (трубку 1 на каждые 10 мл крови, 6 труб в донора). Развести крови 1: 1 с фосфатом Дульбекко-Buffered Соленая (DPBS). Наклоните пробирку, содержащую центрифугирования в градиенте плотности среды до угла 20 ° с рабочей поверхности. Использование помощи пипетки и 25 мл серологической пипеткой медленно слой 21 мл разбавленной крови в верхней части среды, постепенно добавляя кровь вниз к стенке трубки наклонной. Примечание: Это позволит свести к минимуму перемешивание крови с градиентом плотности слоя и будет производить более плотное поглощающее покрытие, а также улучшенную выход. Центрифуга образцов при 400 мкг в течение 35 мин при комнатной температуре с ускорителем и вынул. В течение этого периода центрифугирования, начать коллагена покрытие, описанную в шагах 2.1 – 2.4. Убедитесь, эти шаги были завершены, прежде чем приступить к шагу 3.1. 2. Коллаген Покрытие Т-75 колбу и подготовки питательной среды ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в капот культуре клеток. Подготовка 50 мкг / мл раствора коллагена путем разбавления акции Tyре коллагена в 10 мл 0,02М уксусной кислоты. Пример: для коллагена складе в концентрации 4,05 мг / мл, добавляют 123,5 мкл коллагена 10 мл 0,02 М уксусной кислоты. Стерильный фильтр коллагена подвески перед использованием. Использование серологических пипетки, добавьте 7,5 мл раствора коллагена в культуре клеток колбу Т-75. Этот объем дает 5 мкг коллагена / см 2 (или 375 мкг / колбу). Шерсть колбу в течение 1 часа при комнатной температуре. Подготовка эндотелиальных среду роста, используемый для BOEC поколения, дополняя эндотелия базальной среды дополнений фактора роста, предоставляемых производителем. Добавить все добавки, но не добавлять сыворотку. Для приготовления 15 мл среды BOEC поколения, добавить 2,5 мл определенного фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 12,5 мл эндотелиальных среды роста, содержащей добавки фактора роста. Продолжайте действия, описанные в разделе 3. После периода покрытия 1 час, аспирации раствора коллагена и смыть остаточных уксусной кислоты с помощью пипеткив 10 мл DPBS. Аспирируйте от DPBS и повторить этот шаг мыть еще раз. Если полученной клеточной суспензии во время этапа 3.3 не готов для посева в это время, добавьте 5 мл среды BOEC поколения в колбу, чтобы сохранить коллагена покрытие от высыхания. 3. Сбор и покрытие из PBMNCs После центрифугирования в градиенте плотности указано в пункте 1.4, тщательно собрать Баффи пальто слой, используя стерильный пластиковый пипетки передачи. Сбор и светлый сгусток должен давать примерно 20 мл суспензии клеток и плазмы из каждой пробирки. Избегайте передачи градиента плотности среды. Развести подвеску мононуклеарных клеток 1: 1 в DPBS и инвертировать перемешать. Центрифуга при комнатной температуре в течение 20 мин при 300 х г с тормозом и ускорителем на максимум. После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления 1 мл среды BOEC поколения на каждую гранулу и пипетки вверх и вниз несколько раз. Бассейн клеточные суспензиид долить общий объем до 10 мл с оставшейся среде. Чтобы получить оценку общего числа клеток, образец 10 мкл клеточной суспензии и разбавленной 50x с 490 мкл раствора Турка, которые будут лизировать красные кровяные клетки. Граф 10 мкл образца разведенной суспензии клеток с использованием гемоцитометра. ПРИМЕЧАНИЕ: 60 мл крови должно дать около 100-150 х 10 6 белых кровяных клеток для обшивки. Пластина подвески все клетки в единую коллагена покрытием Т-75 колбу, пополнить объем среды 15 мл, чтобы / колбу и культуры при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO 2. Клетки высевали в это время представляют проход 0. ПРИМЕЧАНИЕ: Можно заморозить изолированных PBMNCs до BOEC изоляции для того, чтобы вывести на BOECs на более позднее время или для того, чтобы транспортировать PBMNCs в другой лаборатории, где BOECs могут быть сформированы. Тем не менее, важно отметить, что замораживание может PBMNCs снижают эффективность изоляции BOEC. SEE раздел 8 ниже способом. 4. Долгосрочное Культура клеток Изменение средней каждые 2 дня, добавив 15 мл свежей среды BOEC поколения (5: 1 смеси эндотелиальной среде для роста клеток и определили FBS). Для выходных, средние изменения может быть отложено на каждые 3 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: вырост колонии должны появиться между 7 и 14 дней культуры. Монитор BOEC культуральной колбы на 7-14 дней для появления вырост колоний. Определить колонии в виде круговых групп клеток, проявляющих классический эндотелия булыжника морфологию. После того, как колонии или несколько колонии идентифицировали в колбе, продолжают со средними изменений и позволить расти колонии примерно 1000 до 2000 клеток на колонии, прежде чем пассирования. Определить количество клеток на колонию через грубой визуальной оценки. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве руководства, это общепринято, чтобы прохода начальных колоний вырост одну неделю после идентификации первого вырост колонии. <Li> смешанные клетки путем промывки колбы дважды 10 мл DPBS. Добавляют 5 мл 1X трипсина-ЭДТА и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин. Через 5 мин, нейтрализуют трипсин с 10 мл среды (содержащей FBS) и довести клеток в суспензии с повторным пипетированием. Центрифуга суспензии при 300 мкг в течение 5 мин, ресуспендируют в 15 мл свежей среды BOEC поколения и пластины весь клеточной суспензии в новый Т-75 колбу (представляющего прохода 1, P1). Нет коллагена покрытие не требуется. Продолжить среднего изменения, как описано выше, пока клетки не сливающихся (примерно 3-5 × 10 6 клеток на колбу). После сли ни, клетки проход, как описано в шаге 4.3. ПРИМЕЧАНИЕ: Из прохода 2 года, клетки больше не требуется среду BOEC поколения и может культивироваться в эндотелиальных клеток ростовой среды и 10% стандартной инактивированной нагреванием FBS. Коллаген покрытие может быть использован в качестве необязательный шаг идти вперед, так как есть основания полагать, что наличие коллагена может повысить BOEC proliferAtion ставки. Для дальнейшего пассирования, плиты не менее чем 750000 клеток на Т-75 колбу, как плотность низкая клеток могут привести к BOECs, чтобы остановить пролиферирующих. 5. Замораживание и оттаивание BOEC Культуры Trypsinize клетки, как описано в разделе 4.3 и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 10 мл среды. Это не требует эндотелиальных клеток ростовой среды; DMEM с 10% FBS стандартных будет достаточно. Сбор 10 мкл образца суспензии клеток, чтобы выполнить вручную количества клеток с помощью гемоцитометра. Центрифуга снова ресуспендируют в и 2х10 6 клеток / мл в охлажденном льдом криоконсервации среды (40% DMEM с 50% FBS и 10% ДМСО). Добавить 0,5 мл (10 6 клеток) в каждом флаконе, место флаконы в ледяной холод изопропанол криоконсервации судна и места в -80 ° C морозильник по крайней мере 2 часа прежде, чем перейти к жидким азотом. Не оставить клетки при -80 ° С в течение более 24 часов. </lя> Для таять клетки, добавить 10 мл подогретого среды в 15 мл коническую центрифужную пробирку. ПРИМЕЧАНИЕ: При оттаивать Прохождение 1 клеток, оттепель в эндотелиальных клеток ростовой среды, дополненной 20% FBS, определенной в течение первых 2 дней после оттаивания. Это приводит к изоляции более стабильной клеточной идти вперед. Удалите клетки от жидкого азота и оттепели в 37 ° C бане воды с перемешиванием до тех пор, нежной лишь небольшое кристаллов льда осталось во флаконе. Добавить содержимое флакона по каплям к конической центрифужную пробирку и спин вниз в 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и осадок ресуспендируют клеток в 10 мл EGM-2 мВ + 10% FBS. Добавить в Т-75 колбу и пополнить среды до 15 мл. 6. Характеристика BOECs с помощью проточной цитометрии После того, как BOEC колонии, описанные в разделе 4 было разрешено расширить, Trypsinize клетки, как описано в разделе 4.4 и ресуспендируют при концентрации 10 6 клеток на мл в буфере окрашивания (DPBS остроумиеч 2% FBS и 2 мМ ЭДТА). Комбинат 10 5 клеток флуорохромом конъюгированного антител, направленных против CD45, CD14, CD34, CD31 (использовать все в 1:20 разбавления) или VEGFR2 (разбавить 1:10) (см таблицу 1 для получения подробной информации). Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в темноте. Промыть клетки с 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 400 мкл буфера для окрашивания для анализа. Сохранить клетки при 4 ° С в защищенном от света перед анализом. Выполнение цитометрии анализ на цитометр возможности для выявления флуоресцентно конъюгированных антител, используемых в анализе. Использование неокрашенной BOEC образец для идентификации клеточной популяции на цитометр, регулируя вперед и боковое рассеивание напряжений, а также напряжения для каналов FITC и APC. Определить стробирования пороги, используя изотипа окрашенных клеток для каждого флуорохромом. Оценка позитивности для каждого маркера клеточной поверхности на основе presencе пиковой сдвига в интенсивности флуоресценции по сравнению с контролем изотипа для флуорохромом анализируются. 7. Характеристика BOECs по иммунофлуоресцентных микроскопии Пластинчатые BOECs в 24-а, плоским дном планшета для культуры ткани без покровных при плотности 5 х 10 4 клеток в 500 мкл эндотелия среде роста клеток + 10% тепла инактивированной ФБС на лунку и оставить придерживаться и расти при 37 ° С, 5% СО 2 до клеток охватывать по крайней мере 70-80% площади поверхности каждой лунки (оценка слияния путем визуального осмотра под световым microsope). Вымойте клеток в каждой лунке в течение 5 мин с 1 мл DPBS. Исправление клетки O / N при 4 ° С с 500 мкл 4% -ного раствора параформальдегида в DPBS. Промыть клетки в течение 3 х 5 мин с 1 мл на лунку DPBS. Добавить и удалить DPBS помощью пипетки и аспиратор, соответственно. Проницаемыми клеток для 3 х 10 мин с 0,2% полисорбата 20 в DPBS. </li> Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в блокирующем буфере, содержащем 10% FBS в DPBS. Пятно клетки при 4 ° CO / N в 300 мкл буфера для разведения антител (0,1% бычьим сывороточным альбумином в DPBS), содержащей первичные антитела, направленные против CD34 (10 мкг / мл), CD144 (1: 300) или фактора Виллебранда (1: 250) , В таблице 1 для получения полной информации. Смыть несвязанных первичных антител в течение 5 х 10 мин с DPBS. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре с соответствующим флуоресцентно-меченного вторичного антитела, как указано в таблице 1 (все в 1: 200). Смыть несвязанных вторичных антител в течение 5 х 10 мин с DPBS. Инкубируйте клетки с 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть клетки с DPBS в течение еще 3 мин х 5. Клетки изображение в 100-кратном увеличении, используя инвертированный микроскоп оснащен внешним источником света для возбуждения флуоресценции, и захват изображения с помощью приложитьред цифровая камера для последующего анализа в автономном режиме. 8. замораживание и оттаивание PBMNCs В конце стадии 3.2, После центрифугирования аспирата среды и вручную разрушить осадок клеток с повторным пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки P1000 наконечник. Добавить 1 мл замораживания среды, 90% сыворотки и 10% ДМСО, убедившись, что аккуратно перемешать, чтобы произвести клеточной суспензии. Передача клеточной суспензии криопробирку и размораживать, как описано в разделе 5.