ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

BOEC生成プロトコルの概略図を図1に示されています。 1.採血や密度勾配遠心各ドナーのために、2つの50mlコニカル遠心管のそれぞれにクエン酸ナトリウムを3mlを加えます。静脈穿刺によって血液の60ミリリットルを収集し、各チューブに30ミリリットルを追加します。混合する優しく2〜3回反転します。それに応じて調整クエンボリュームで、プロトコルで血液のわずか40ミリリットルを使用してください。 注：血液サンプルを採取後2時間以内に処理されることが不可欠です。成長コロニー収率の著しい減少で血液結果の処理を遅延。 まず混合するボトルを数回反転させて密度勾配遠心分離媒体を含む新しいコニカルチューブを準備します。無菌フードでは、50mlコニカルチューブ（血液のすべての10ミリリットルのための1チューブ、ドナーあたり6チューブ）あたりの密度勾配遠心分離培地の15ミリリットルを追加します。 ダルベッコのリン酸を1：1に希釈血液-Buffered生理食塩水（DPBS）。作業面と20°の角度に密度勾配遠心分離媒体を含むチューブを傾け。ピペットエイドおよび25 mlの血清学的ピペットを使用して、ゆっくりと徐々に傾斜管の壁ダウン血液を添加することにより、媒体上に希釈された血液を21 mlのレイヤ。 注：これを行うと、密度勾配層と血液の混合を最小限に抑えることができますし、より厳しいバフィーコートだけでなく、強化された収量を生成します。 アクセルとブレーキをオフにして室温で35分間、400×gで遠心分離し、サンプル。 2.4 – この遠心分離期間中、ステップ2.1で詳述コラーゲンコーティングを開始します。これらの手順は、3.1のステップに進む前に完了していることを確認します。 T-75フラスコおよび培養培地の調製の2コラーゲンコーティング注：細胞培養​​フードで次の手順を実行します。 在庫のTyを希釈して50μg/ mlのコラーゲン溶液を準備します私は0.02M酢酸10mlにコラーゲンPE 例：コラーゲン在庫について4.05 mg / mlの、0.02 M酢酸10 mlにコラーゲンの123.5μLを加えるの濃度で。滅菌フィルターコラーゲン懸濁液を使用前。 血清学的ピペットを使用して、T 75、細胞培養フラスコへのコラーゲン溶液の7.5 mLを加え。このボリュームは、5μgのコラーゲン/ cm 2の（または375μgの/フラスコ）を与えます。 RTで1時間コートフラスコ。 メーカーが提供する成長因子サプリメントと内皮基礎培地を補充することによってBOEC生成に使用される血管内皮増殖培地を準備します。すべてのサプリメントを追加するが、血清を追加しないでください。 BOEC生成培地15mlのを準備するために、成長因子サプリメントを含有する内皮増殖培地の12.5 mlに定義されたウシ胎児血清（FBS）を2.5mlを加えます。 、1時間のコーティング期間の後第3節で説明したステップに進んでコラーゲン溶液を吸引し、ピペッティングにより残留酢酸を洗い流します10ミリリットルのDPBSインチDPBSを吸引除去し、もう一度この洗浄ステップを繰り返します。ステップ3.3の間に得られた細胞懸濁液は、この時点でめっきする準備ができていない場合は、乾燥アウトからコラーゲンコーティングを維持するためにフラスコにBOEC世代媒体5mLのを追加します。 3.収集とPBMNCsのめっきステップ1.4において概説密度勾配遠心分離後、注意深く滅菌プラスチック製トランスファーピペットを用いて、軟膜層を収集します。軟膜の収集は、各チューブからの細胞懸濁液とプラズマの約20ミリリットルが得られるはずです。密度勾配媒体を移送避けます。 単核細胞懸濁液1を希釈：DPBS中1と混合するために反転します。最大でブレーキとアクセルで300×gで20分間、室温で遠心分離します。 遠心分離した後、ダウンを繰り返し、各ペレットにBOEC世代培地1mlを添加し、ピペッティングにより上清および再懸濁細胞を吸引します。プール細胞は、懸濁液残りの培地で10mlにDトップアップ総容量。 総細胞数、細胞懸濁液のサンプルを10μlの推定を取得し、赤血球を溶解しますチュルク液490μLで50倍に希釈します。血球計数器を用いて希釈細胞懸濁液の10μlのサンプルをカウントします。 注：血液の60mLのがめっきに約100〜150×10 6の白血球細胞が得られるはずです。 シングル、コラーゲンコートT-75フラスコにプレート全体の細胞懸濁液、5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で15mLの/フラスコと文化にトップアップ中量。この時点で播種した細胞は、継代0を表します。 注：これは、後で、またはBOECsを生成することができる別の研究所にPBMNCsを輸送するためにBOECsを導出するために前のBOEC分離に孤立PBMNCsを凍結することが可能です。しかし、凍結PBMNCsはBOEC分離の効率を低下させることができることに留意することが重要です。 S方法については、以下のEE部8。 4.長期細胞培養新鮮BOEC生成培地15mlを加えることによって、培地を2日毎に変更（5：内皮細胞増殖培地の1：1混合物およびFBSを定義）。週末のために、培地の変更は、3日ごとに遅延させることができます。 注：伸長コロニーを培養7日および14日の間に表示されます。 成長コロニーの出現のために日7月14日にBOEC培養フラスコを監視します。古典的な内皮石畳の形態を示す細胞の円形グループなどのコロニーを識別します。 コロニーまたは複数のコロニーをフラスコ内で識別されると、メディアの変更を続行し、コロニーが継代前にコロニー当たり約1000〜2000個の細胞まで成長することができます。ラフ視覚推定を通じてコロニーあたりの細胞数を決定します。 注：ガイドとして、それは一週間最初の成長コロニーの同定後の経過初期の成長コロニーのが通例です。 <LI> DPBS 10mlで二回フラスコをすすぐことによって継代細胞。 1Xトリプシン-EDTAの5 mlを加え、5分間37℃のインキュベーターでインキュベートします。 5分後、培地（FBSを含有する）を10 mlのトリプシンを中和し、ピペット操作を繰り返すと、懸濁液中に細胞をもたらします。 遠心5分間300×gでサスペンション、新鮮BOEC世代培地15ml中に再懸濁し、（継代1、P1を表す）は、新しいT-75フラスコに、全細胞懸濁液をプレート。いいえコラーゲンコーティングは必要ありません。 細胞がコンフルエント（フラスコ当たりおよそ3〜5×10 6個の細胞 ）になるまで上記のように培地交換を続けます。コンフルエント後、継代細胞、ステップ4.3に記載のように。 注：以降通路2から、細胞はもはやBOEC生成培地を必要とせず、内皮細胞増殖培地と10％の標準的な熱不活性化FBSで培養することができます。コラーゲンの存在がBOEC proliferを高めることができることを示唆する証拠があるので、コラーゲンコーティングは、今後の任意のステップとして使用することができエーション率。 継続継代のために、などの低細胞密度がBOECsが増殖を停止させることができ、T-75フラスコあたり75万細胞よりも少ないプレートなし。 5.凍結融解BOEC文化 5分間300×gで4.3節と遠心分離機で説明したように細胞をトリプシン処理。培地10mlに再懸濁上清を吸引除去します。これは、内皮細胞増殖培地を必要としません。 10％標準FBSを含むDMEMで十分です。血球計数器を使用して、手動細胞数を実行するように細胞懸濁液の10μlのサンプルを収集します。 氷のように冷たい凍結保存培地（50％FBSおよび10％DMSOを40％のDMEM）で2×10 6細胞/ mlで再遠心し、再懸濁します。液体窒素に転送する前に少なくとも2時間、-80℃の冷凍庫で氷冷イソプロパノール凍結保存容器と場所に場所バイアルを、各バイアルに0.5ミリリットル（10 6細胞 ）を追加します。以上24時間-80℃で細胞に放置しないでください。 </lI> セルを解凍するには、15ミリリットルコニカル遠心チューブに予め温めた培地10mlを追加します。 注：継代1細胞を解凍する場合、解凍後の最初の2日間のFBSを定義して20％を補充した内皮細胞増殖培地中に解凍します。これは、今後、より安定した細胞の単離につながります。 わずかな氷の結晶がバイアル内に残されるまで、穏やかに攪拌しながら37℃の水浴中で液体窒素と融解から細胞を取り出します。コニカル遠心チューブにバイアル滴下の内容を追加し、5分間300×gでスピンダウン。 10ミリリットルEGM-2MV + 10％FBS中で上清を吸引および再懸濁細胞ペレット。 T-75フラスコとトップまで15ミリリットルの培地に追加します。 フローサイトメトリーによるBOECsの6キャラクタリゼーション染色緩衝液1ml当たり10 6細胞の濃度でセクション4.4および再懸濁で説明したように第4節で説明BOECコロニーは、トリプシン処理細胞を拡大することが許可されたら（DPBSウィットH 2％FBSおよび2mM EDTA）。 CD45、CD14、CD34、CD31（一時20希釈ですべてを使用）またはVEGFR2（1:10希釈）（詳細については表1を参照）に対する蛍光標識抗体を用いて10 5個の細胞を結合します。暗所で4℃で30分間インキュベートします。 5分間300×gで1ミリリットル染色緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄します。上清を吸引し、分析のために400μlの染色緩衝液中に再懸濁します。 4℃で細胞を維持し、分析前に、光から保護。 アッセイで使用する蛍光標識抗体を検出するために装備サイトメーター上のサイトメトリー分析を実行します。 前方調整および側方散乱電圧だけでなく、FITCおよびAPCのチャネルの電圧によってサイトメーターで細胞集団を識別するために染色されていないBOECサンプルを使用してください。 各蛍光色素のためのアイソタイプ染色された細胞を使用してしきい値をゲートするかを決定します。 presencに基づいて、各細胞表面マーカーの陽性を評価蛍光色素のためのアイソタイプコントロールに対する蛍光強度のピークシフトのeが分析されています。 免疫蛍光顕微鏡によるBOECsの7キャラクタリゼーションプレートBOECs内皮細胞増殖培地500μl中5×10 4個の細胞ウェル当たり+ 10％熱不活性化FBSの密度でカバースリップなしの24ウェル、平底組織培養プレート中で、37に付着して成長するままにC°、5％CO 2の細胞がウェル（光microsope下で目視検査によって推定コンフルエントに）それぞれの面積の少なくとも70〜80％をカバーするまで。 DPBS 1mlで5分間、各ウェル中の細胞を洗浄します。 DPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液500μlを用いて4℃で細胞O / Nを修正。 ウェルあたりのDPBS 1mlで3×5分間、細胞を洗浄します。それぞれ、ピペットと吸引器を使用して、DPBSを追加し、削除します。 DPBS中0.2％のポリソルベート20で3×10分間、細胞を透過性。 </li> DPBS中に10％FBSを含有するブロッキング緩衝液中で室温で1時間、細胞をインキュベートします。 またはvWFを（1：250）：CD34（10 / mlの）、CD144（300 1）に対する一次抗体を含む抗体希釈緩衝液（DPBS中の0.1％ウシ血清アルブミン）300μlの中で4°CO / Nで染色細胞。詳細については表1 を参照してください。 DPBSで5×10分間の未結合の一次抗体を洗い流します。 （1：200ですべての） 表1に詳述するように、適切な蛍光標識二次抗体と室温で1時間、細胞をインキュベートします。 DPBSで5×10分間、非結合二次抗体を洗い流します。 RTで10分間、DPBS中1μg/ mlの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で細胞をインキュベートします。 さらに3×5分間DPBSで細胞を洗浄。 アタッチ用いた蛍光励起用の外部光源を備えた倒立顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像セル、キャプチャ画像その後の分析をオフラインでのEDデジタルカメラ。 8.凍結融解PBMNCs ステージ3.2の終了時に、遠心分離後、培地を吸引し、手動で繰り返しピペッティングを上にして、およびP1000のピペットチップを使用したダウン細胞ペレットを崩壊させます。細胞懸濁液を生成するために穏やかに混合することを確認し、凍結培地、90％血清、10％DMSO中の1ミリリットルを追加します。第5節で説明したようにクライオバイアルと凍結融解に細胞懸濁液を転送します。