人外周血代文化血液的产物内皮细胞

所述BOEC生成协议的示意图示于图1。 1.采血车和密度梯度离心对于每一个捐赠者，加3毫升柠檬酸钠每两个50毫升锥形离心管中。收集将60ml静脉抽血，并加30毫升每管。反转轻轻2-3次混合。使用少到40个毫升血液中的协议，与相应的调整柠檬酸卷。 注：重要的是血液样品2小时内收集的处理。延迟显着减少生长菌落产量血结果的处理。 制备含有密度梯度离心介质通过首先颠倒瓶子几次以混合新锥形管。在无菌罩，每50 ml的新增15 ml的密度梯度离心介质的锥形管（1管每10毫升血液，每个供体6管）。 稀释血液1:1用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）。倾斜含有密度梯度离心介质为20°的工作表面的角度的管。使用移液管助剂和25毫升血清吸管，缓缓通过逐渐加入血液向下倾斜管壁层上的介质的顶部21毫升稀释血。 注意：这样做将减少血液与密度梯度层的混合和将产生更紧密的血沉棕黄层，以及增强的产量。 离心样品在400×g离心35分钟，在室温与加速器和制动器关闭。 在此离心期间，开始胶原蛋白涂层步骤详见2.1 – 2.4。确保在进行步骤3.1之前，这些步骤已经完成。 的T-75烧瓶和培养介质的制备2胶原涂层注：执行在细胞培养罩以下步骤。 通过稀释股票泰准备50微克/毫升胶原溶液PE I型胶原在10ml 0.02M乙酸实施例的：对胶原的库存为4.05毫克/ ml的浓度，添加123.5微升胶原至10毫升的0.02M乙酸。无菌过滤器胶原悬浮液在使用之前。 使用血清吸管，加7.5毫升的胶原溶液为T-75细胞培养瓶。本卷给出了5微克胶原/ 平方厘米（或375微克/瓶）。外套烧瓶1小时，在室温。 准备通过补充内皮基础培养基与由制造商提供的生长因子补充剂用于BOEC代内皮生长培养基中。添加所有的补充，但不添加血清。为了制备15毫升BOEC代培养基中，添加2.5 ml的限定的胎牛血清（FBS）的12.5毫升含有生长因子补充剂内皮生长培养基。 继续执行在第3节中列出的1小时涂层期后的步骤，吸出胶原溶液洗去残留乙酸吹打在10ml DPBS。吸落DPBS并重复此清洗步骤一次。如果在步骤3.3中得到的细胞悬浮液是没有准备好，此时电镀，BOEC生成介质的添加5毫升的烧瓶中，以保持从干燥出胶原涂层。 3.收集和外周血单个核细胞的电镀以下，在步骤1.4中概述的密度梯度离心，小心收集使用无菌塑料移液管血沉棕黄层层。收集的棕黄色大衣应该从每管产生约20 mL细胞悬液和血浆。避免传输密度梯度​​介质。 稀释单个核细胞悬液1:1 DPBS并颠倒混合。离心在RT 20分钟，在300×g离心以制动器和加速器最大。 离心后，通过加入1ml BOEC生成介质的与每个粒料和吹打上下反复吸出上清，重悬细胞。游泳池细胞悬液的ð充值总额10毫升，其余网上平台。 为了获得总细胞数，样品10微升细胞悬浮液的估计和稀释50倍与490微升土耳其人的解决方案，这将溶解红细胞。计数使用血球稀释细胞悬浮液的10微升样品。 注：血液60毫升应为电镀收率约100-150×10 6个白细胞。 板整个细胞悬浮液到一个单一的，胶原包被的T-75烧瓶中，补足培养基体积到15毫升/烧瓶中并培养在37℃下在含有5％ 的 CO 2的潮湿空气中。细胞铺板在这个时候表示通道0。 注意：可以将冷冻的外周血单个核细胞分离之前BOEC隔离以导出BOECs在稍后的时间或在为了运输的外周血单个核细胞，以不同的实验室可以在其中生成BOECs。然而，值得注意的是，冷冻外周血单个核细胞可以减少BOEC隔离的效率是重要的。小号下面EE第8条的方法。 4.长期细胞培养通过加入15毫升新鲜BOEC代介质改变每2天介质（5：1的混合物内皮细胞生长培养基中，并限定FBS）中。在周末，介质改变可以延迟到每3天。 注：生长菌落7至14天的培养出现。 监测7-14天的生长菌落外观BOEC培养瓶中。确定殖民地的细胞表现出典型的内皮细胞的鹅卵石形态圆形群体。 一旦一个群体或多个群体中的烧瓶中确定，继续用中的改变，允许菌落传代才增长到大约1000至2000个细胞每殖民地。通过粗略目测估计确定每个细胞集落细胞数。 注：作为指南，这是习惯通过初始生长的菌落一个星期后的第一个产物殖民地的身份。 <LI>传代细胞冲洗两次瓶10毫升的DPBS。加入5 ml的1X胰蛋白酶-EDTA的孵育在37℃的培养箱中培养5分钟。 5分钟后，中和胰蛋白酶，用10毫升（含FBS）培养基中，并把细胞悬浮进反复移液。 离心悬浮液在300×g离心5分钟，悬浮在15毫升新鲜BOEC代介质和板整个细胞悬液到一个新的T-75烧瓶（表示通道1中，P1）。没有胶原涂层是必需的。 继续如上所述直到细胞汇合（每瓶约3-5×10 6细胞）的培养基的变化。一旦汇合，代细胞如步骤4.3中所述。 注意：从第2代开始，细胞不再需要BOEC生成介质，并且可以是在内皮细胞生长培养基和10％的标准热灭活FBS中培养。胶原涂层可以作为一个可选步骤前进，因为有证据表明，胶原蛋白的存在可以增强BOEC prolifer通货膨胀率。 对于连续传代，盘不下75万细胞每T-75瓶低细胞密度会导致BOECs停止增殖。 5.冻融BOEC文化 4.3节和离心机在300 XG描述5分钟Trypsinize细胞。吸出上清液，重悬在10毫升培养基。这并不需要内皮细胞生长培养基;含10％FBS的标准将是足够的。收集的细胞悬浮液10微升样品使用血球执行手动细胞计数。 离心再次重悬在2×10 6个细胞/在冰冷的冻存培养基（40％DMEM，50％FBS和10％DMSO）中毫升。加入0.5毫升（10 6个细胞）到每个小瓶中，小瓶的地方，在冰冷的异丙醇冻存容器并将其放置在-80℃冷冻至少2小时之前转移到液氮中。不要让电池在-80℃下超过24小时。 </l我> 解冻细胞，加入10 ml的预热介质到15ml锥形离心管中。 注意：当解冻出通道1细胞，解冻成补充有限定FBS的解冻后的第2天的20％的内皮细胞生长培养基。这导致更稳定的细胞分离前进。 除去从液氮和解冻在37℃水浴中，轻轻摇动细胞直到只有小冰晶留在小瓶中。的小瓶滴加的内容添加到所述锥形离心管和降速，在300×g离心5分钟。 吸去上清液和重悬细胞沉淀在10ml EGM-2MV + 10％FBS。加入T-75瓶加满油中到15ml。 BOECs通过流式细胞仪6.表征曾在第4节中描述的BOEC殖民地被允许扩大，trypsinize细胞作为第4.4节，重悬在每毫升10 6细胞染色缓冲液的浓度描述（DPBS机智H 2％FBS和2mM EDTA）中。 结合10 5个细胞与针对CD45，CD14，CD34，CD31（使用全部1:20稀释）或VEGFR2（稀释1:10）荧光标记的抗体（ 见表 1的全 ​​部细节）。在黑暗中温育30分钟，在4℃。 洗涤细胞用1ml染色缓冲液和离心机在300×g离心5分钟。吸上清，重悬在分析400微升染色缓冲液。保持细胞在4℃下并避光到分析前保护。 进行细胞计数分析在装有以检测测定中使用的荧光标记的抗体细胞仪。 使用未染色BOEC样品通过调整前向和侧向散射的电压，以及用于FITC和APC通道的电压，以确定在流式细胞仪的细胞群。 确定选通使用同型染色的细胞为每个荧光阈值。评估阳性基于所述presenc每个细胞表面标记物Ë峰值转变荧光强度与同种型对照的荧光染料被分析。 BOECs通过免疫荧光7.表征板BOECs在24孔，平底组织培养板，而不盖玻片以5×10 4个细胞的500微升内皮细胞生长培养基的密度+ 10％热灭活的每孔FBS和离开附着并生长在37 ℃，5％的CO 2，直至细胞覆盖每个的表面积的至少70％-80％以及（通过目测估计汇合下的光microsope）。 在每5分钟1毫升的DPBS洗涤细胞良好。 修复细胞O / N在4℃下用500微升的DPBS 4％多聚甲醛溶液。 为3×5分钟1毫升每孔的DPBS洗涤细胞。添加和删​​除用移液管和吸气的DPBS，分别。 通透细胞3×10分钟，0.2％聚山梨醇酯20中的DPBS。 </li> 在封闭含有10％FBS的DPBS中缓冲孵育细胞1小时，在室温。 在300微升抗体稀释缓冲液中含有针对CD34（10微克/毫升），CD144第一抗体（在DPBS中的0.1％牛血清白蛋白）染色的细胞在4℃CO / N（1：300）或vWF的（1：250） 。 请参阅表1的全 ​​部细节。 为5×10分钟用DPBS冲洗掉未结合的初级抗体。 孵育细胞1小时在室温用适当的荧光标记的第二抗体，如（1所有：200）详述于表1中。 为5×10分钟用DPBS冲洗掉未结合的二抗。 孵育细胞与1mg / ml的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在DPBS在室温10分钟。 另外3×5分钟洗涤细胞用DPBS。 在放大100倍使用倒置显微镜配备有外部光源，用于荧光激发用附加图像的细胞，并捕获图像编数码相机进行后续分析离线。 8.冻融外周血单个核细胞在阶段3.2的端部，以下离心，吸出介质并手动破坏细胞沉淀反复吹打上下使用P1000枪头。加入1毫升冷冻培养基，90％血清和10％DMSO的，确保轻轻混匀，以产生细胞悬浮液。细胞悬液转移到离心管和冻结和解冻的第5节。