جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان
Summary
This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.
Abstract
Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.
Introduction
حتى وقت قريب، كان يعتقد أن جيل ما بعد الولادة الأوعية الدموية الجديدة أن تحدث بشكل حصري من خلال عملية تعرف باسم الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه تنتشر سفن جديدة من الخلايا البطانية للأوعية موجودة من قبل. 1 هذه العملية تتناقض من تكون الأوعية، أو تشكيل دي نوفو الأوعية الدموية من أسلاف البطانية، الذي كان يعتقد أن يحدث حصرا أثناء التطور الجنيني. 2 ومع ذلك، وقد حددت الدراسات الأكثر حداثة وعزل تعميم الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) في الدم المحيطي الكبار. هذه الخلايا تمتلك القدرة على التمايز إلى خلايا البطانية ناضجة في الثقافة ويعتقد على المشاركة في تكون الأوعية بعد الولادة. 3،4
بروتوكولات للعزلة وتوسيع هذه EPCS وعادة ما تشمل ثقافة الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) في وسائل الإعلام التي تحتوي على عوامل النمو البطانية، بما في ذلك vasculعامل AR البطانية النمو (VEGF)، وعامل نمو الخلايا الليفية-2. 5-8 الثقافات EPC تنتج مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا بشكل كبير. الثقافات الأولية (<7 أيام) ويغلب عليها نوع من الخلايا الوحيدات، والمعروف في الأدب بأنه "في وقت مبكر" EPCS. على الرغم من اسمها، وهذه الخلايا تعبر عن CD14 الوحيدات علامة، هي سلبية للCD34 السلف علامة والتعبير عن مستويات الحد الأدنى فقط من الكلاسيكية البطانية علامات CD31 وVEGF مستقبلات 2 (VEGFR2). 5 الثقافة استمرار يثير سكان الثانوي من الخلايا، المعروفة باسم EPCS أواخر ثمرة أو الخلايا البطانية ثمرة الدم (BOECs)، والتي تظهر المستعمرات سرية اعتبارا من خلايا تشبه الخلايا البطانية. وخلافا للEPCS مبكرة الوحيدات، BOECs، والتي أيضا تم استدعاء مستعمرة تشكيل الخلايا البطانية (ECFCs)، الخلايا البطانية ثمرة أو الخلايا البطانية في وقت متأخر من ثمرة، يحمل التشكل المرصوفة بالحصى التي هي الحال في الطبقات الوحيدة الخلية البطانية وتشبه إلى حد كبير في علامة السطح5 والتعبير الجيني 9 إلى أن تنضج الخلايا البطانية.
توليد خلايا تشبه الخلايا البطانية من الدم المحيطي يوفر العديد من المزايا، وخاصة لدراسة الخلل الخلايا البطانية المرتبطة اضطرابات الأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم الرئوي الشرياني (PAH) 10 أو فون ويلبراند المرض. 11 قبل توافر BOECs، البطانية لا يمكن إلا أن تكون مشتقة من خلايا أجهزة explanted في وقت الوفاة أو زرع الأعضاء، أو معزولة من الوريد السري عند الولادة. هذا انخفاض توافر يمثل قيدا خطيرا على فهم بيولوجيا الخلايا البطانية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات القلب والأوعية الدموية، وكذلك التفاعلات بين الخلايا البطانية وإما خلايا الدم أو الخلايا الجدارية. وعلاوة على ذلك، عزل وزراعة السكان نقية من الخلايا البطانية من هذه المصادر يشكل تحديا فنيا والخلايا التي يحصل عليها هذه الأساليب يحمل سوى يميتالقدرة التكاثري د. لذا BOECs تقديم بديل قيمة للعزلة وثقافة من الخلايا البطانية الأولية المستمدة من المريض.
بالإضافة إلى المختبر في طلباتهم، BOECs أيضا يمكن أن تكون مفيدة في علاج ذاتي زرع الخلايا. وتشمل هذه التطبيقات على حد سواء زرع البطانية خلية لتعزيز اتساع الأوعية الدموية (انظر 12 والمراجع فيه)، فضلا عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). 13 iPSCs BOEC المشتقة يمكن أن تستخدم لنمذجة المرض وتوفر إمكانات هائلة مثل الانطلاق المواد اللازمة لعلاج الخلايا ذاتي. BOECs برمجة أسرع وبكفاءة أعلى من الخلايا الليفية الجلد. وعلاوة على ذلك، BOECs أيضا السماح لتوليد iPSCs أن تكون خالية من العيوب النمط النووي، الذي هو سمة أساسية من سمات أي تكنولوجيا من شأنها أن تكون مناسبة لتطبيقات متعدية. القدرة على توليد iPSCs من عينة دم المريضيسوتو يلغي الحاجة لخزعة الجلد وتوليد الخلايا الليفية الجلد، مما يسهل توليد الخلايا من المرضى الذين يعانون من اضطرابات التئام الجروح، أو الصغار جدا.
بروتوكول المفصلة أدناه، التي وافقت عليها والتي تتم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الخدمة أخلاقيات القومي للبحوث (شرق انجلترا)، يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها لتوليد BOECs مع كفاءة أكبر من 90٪ من حجم صغير نسبيا (60 مل) من الدم المحيطي. هذه الخلايا هي التكاثري للغاية ويمكن passaged مرارا وتكرارا، مما يسمح لتوليد مئات الملايين من الخلايا من عينة دم واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke’s Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.
Materials
| For blood collection | |||
| 60 mL syringe with luer-lok tip | BD | 309653 | |
| 19G Surflo Winged Infusion Set | Terumo | SV-19BL | |
| 50 mL conical centrifuge tube | StarLab | E1450 | 2 per donor |
| Sodium Citrate | Martindale Pharmaceuticals | 270541 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For buffy coat isolation | |||
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sterile wrapped plastic transfer pipettes | Appleton Woods | KC231 | |
| Turk’s Solution | Millipore | 1.093E+09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For cell culture, passaging and freezing cells | |||
| Type 1 Collagen (derived from rat tail) | BD Biosciences | 35-4236 | |
| Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.02M Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | prepared in reagent grade water |
| Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum) |
Lonza | CC-3202 | Note: It is essential that the medium does not contain heparin. Do not use EGM-2. |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined | Hyclone | SH30070 | |
| 10x Trypsin EDTA | Gibco | T4174 | Dilute to 1x in PBS prior to use |
| Heat Inactivated FBS | Gibco | 10500-064 | |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For flow cytometric characterization | |||
| FITC-conjugated mouse anti-human CD14 | BD Biosciences | 555397 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD31 | BD Biosciences | 555445 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse anti-human CD34 | BD Biosciences | 555824 | Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 560976 | Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 | R&D Systems | FAB357A | Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10 |
| FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555748 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555751 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | R&D Systems | IC002A Dilution: 1:10 |
Clone: 11711 |
| EDTA, 0.5M solution | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For immunofluorescent microscopy | |||
| Corning Costar 24-well tissue culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody | R&D Systems | MAB72271 | Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml |
| Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) | R&D Systems | AF938 | Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300 |
| Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) | Abcam | ab154193 | Clone EPSISR15, use at 1:250 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21202 | Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200 |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11055 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Life Technologies | A-10042 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 1 μg/ml |
Riferimenti
- Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
- Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334 (2014).
- Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
- Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
- O’Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31 (2012).
- Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).
