JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

İnsan Donör Gözler gelen Bruch Membran zenginleştirilmesi

Published: November 15, 2015
doi:
10.3791/53382
, , ,
1Centre for Ophthalmology & Vision Sciences, Institute of Human Development,University of Manchester, 2Centre for Advanced Discovery and Experimental Therapeutics, Central Manchester University Hospitals NHS Foundation Trust,Manchester Academic Health Science Centre

Summary

Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Abstract

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), gelişmiş ülkelerde görme kaybının önde gelen nedenidir. Hastalık merkezi görme kaybına neden makula denilen retina merkezinin imha kendini gösterir. Erken AMD gibi coğrafi atrofi (AMD kurutmak) ya da neovaskülarizasyon (ıslak AMD) gibi geç AMD üzerine ilerleyebilir yumuşak druzen denilen küçük, sarımsı lezyonların varlığı ile karakterizedir. Klinik değişiklikler de tarif edilmiştir ve AMD riskini veren genetik etkilerin anlaşılması her zamankinden daha detaylı alıyorsanız rağmen, büyük bir ilerleme yoksun bir alan genetik risk biyokimyasal sonuçları bir anlayıştır. Bu Bruch zarının, kan kaynağından malzemenin biyolojik bir filtre ve retina pigment epitelyal (RPE) hücre tekli-tabakası üzerinde bulunduğu bir iskele olarak hareket eden bir çok ince hücre dışı matrisin biyokimya anlama zorluklar kısmen. Drusen fBruch membran ve onların varlığı içinde orm RPE hücreleri besin akışını bozar. Yalnızca diğer proteinler ile etkileşim nasıl gerçekten Bruch membran protein bileşiminin araştırılması ve tarafından, araştırmacılar drusen oluşumunu gelişimini AMD ve sonraki görme kaybı destekleyen biyokimyasal mekanizmaları açıklığa kavuşturabilmek için umut olabilir. Bu kağıdı aşağı biyokimyasal analiz için kullanılan ve bu zaten Bruch membranı biyokimya anlayış değişiyor nasıl örnekler sağlamak, böylece, bütün Bruch membranı, ya da sadece makula bölgesinden ya zenginleştiren metodolojileri ayrıntıları.

Introduction

Oftalmik araştırmalarda ölüm sonrası insan gözü dokusunun kullanılması göz hastalığı patogenezinde anlaşılması için paha biçilemez bir kaynaktır. Insan donör gözlerin Analizi batı dünyasında 1 körlüğün önde gelen nedenidir yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), destekleyen mekanizmaların sezmek için önemli katkılarda bulunmuştur. Küresel olarak, AMD tüm körlük yaklaşık% 8.7 hesapları ve giderek yaşlanan nüfus ile, bu merkezi görme kaybı 2020 2. AMD sonuçları 196 milyon kişiyi etkilediği tahmin ediliyor ve hasta bağımsızlık ve yaşam kalitesi üzerinde derin bir etkisi vardır 3. Erken AMD drusen oluşumu ile karakterizedir ve (aynı zamanda neovasküler veya 'ıslak' AMD olarak anılacaktır) (bazen 'kuru' AMD olarak anılacaktır), coğrafi atrofi, ya da koroid neovaskülarizasyon ilerleyebilir. Anti-VEGF iken enjeksiyonlar stabilize veya neovasküler AMD i vizyon geliştirmekküratif değil ve şu anda hiçbir tedavi coğrafi atrofi için var.

Bazı genetik varyantlar AMD riskini 4 değiştirmek gösterilmiştir iken – 8, daha az bu varyantlar bir biyokimyasal düzeyde makula nasıl etkilediği hakkında bilinmektedir. AMD patogenezinde önemli bir yer Bruch membranı olduğunu. Bu yapı ve çeşitli çalışmalarda druzeni formu ve AMD 9 Bruch zarı çevresinde kompleman aktivasyon kanıtlar sağlamıştır. Bruch membranı koroid retina pigment epitelyal (RPE) hücreleri ayıran hücre dışı matrisin bir tabakadır ve yaklaşık 4 um kalınlığındadır. Bruch membranı koriokapillaris birleştirir, fenestralı kılcal ve bu harici içeren koroid tabakası büyük kan damarlarına 10 (Şekil 1A) içeren tabakalar vardır.

Bruch membranı ekstra bir pentilaminar tabakasıdırhücresel matris (ECM) ve bu metodoloji kırmızı kan hücreleri büyük ölçüde decellularized ve ücretsiz olan (bundan sonra Bruch membranı zenginleştirilmiş anılacaktır) altında yatan koriokapillaris ECM birlikte Bruch membranı izole etmek için nasıl ayrıntıları. Zenginleştirilmiş Bruch Zar daha sonra, batı lekeleme ve histoloji deneyleri için kullanılmıştır. Ayrıca, gözün makula bölgesinden sadece Bruch membranı zenginleştirmek için metodoloji tarif edilir, AMD biyokimyasal yönlerini inceleyen kişilere özel ilgi olacak.

Protocol

Araştırma amaçlı razı İnsan gözü doku nakli için kornea çıkarılmasını takiben Manchester Kraliyet Göz Hastanesi Göz Bankası elde edilmiştir. Araştırma için insan dokusunun kullanılması İnsan Doku Yasası (2004) kurallarına uygun olarak yapıldı ve Üniversitesi Araştırma Etik Kurulu onayı ile (11305 referans). Tüm Bruch Membran 1. zenginleştirilmesi Yaklaşık çalışma alanını temizleyin ve% 1 dezenfektan ile mikroskop altında (h / h) ve daha sonra% 70 (hac / hac) etanol ile silin. Emin olun el şunlardır: (A, B, ve C gibi burada listelenen malzemeler listesine bakınız) yeni bir tek kullanımlık neşter, (genellikle doku kültüründe kullanılan) iki steril hücre kazıyıcı ve cımbız üç çift. Daha sonra kullanmak için kapağı koruyarak atılabilir petri kabına göz küresi yerleştirin. Yeni bir tek neşter kullanılarak, düz bir mo oluşturarak engel olabilir ki, herhangi bir kalıntı optik sinir kaldırmakdoku unt. Sonraki yapmak dört kesiler eşit kısım 3 (maküler Bruch membranı zenginleştirme) geçmeden makula bölgesi kesti yoksa, dört kadran oluşturmak için aralıklı. Içteki retinada (NSR) dan, koroid ve sklera (gözün beyaz) ile – kesiler göz dokusunun tüm derinliği boyunca uzanan emin olun. Insizyon optik sinir Göz yuvası kenarından göz yuvarlak tüm yol devam ediyor. Bu göz kapağı (Şekil 1B bakınız) dümdüz olmasını sağlayacaktır. Cımbız A kullanılarak düzleştirilmiş Göz yuvası bir kadranda Holding merkezine doğru hareket, (koroid dekolmanı önlemek için) kavrama büyük cımbız B vitreus ve altta yatan NSR kullanımı ve çevresinde başlayan uzakta retina pigment epiteli (RPE) Bu doku çekin açılmış Göz yuvası ve daha sonra karşı tarafa. Genellikle, ama her zaman vitreus ve NSR hem biri olarak ayırmak değil. Scalpe kullanınl optik disk demirlemiş herhangi bir kalıntı NSR tüketim için. Yine, cımbız A kullanılarak yerine dokunun bir kadrana sahip iken yavaşça Göz yuvası tüm iç yüzeyinden RPE tek tabaka çıkarmak için steril hücre kazıyıcı kullanılır. Bu hücreler kolayca ayırmak ve koyu kahverengi pigmentli kümeleri görülebilir. Yavaşça Göz yuvası uzak yerinden RPE hücreleri yıkamak için PBS ile durulayın. Sonra, yavaşça Tüm 4 göz kadranlardan (Bruch membranı ve koroid hem oluşan) üstte koyu kırmızı doku soyulmasına cımbız A kullanın. Temiz bir kabına kesilmiş doku yerleştirin. Bir hücre kazıyıcı ve basık kenarını kullanarak, yerinde eksize doku tutun nazikçe doku kazımak için ikinci kazıyıcı kullanın. Mümkün olduğunca fazla malzemeyi kaldırarak, üzerinde doku çevirin ve tekrarlayın. Sonunda, saydam bir zar kalacaktır: Bu kabaca zenginleştirilmiş Bruch membranı olduğunu. 20X büyütme en az mikroskop kullanımıBruch membranı koroid ve zenginleştirme kaldırılmasını yardım gerekli. Pasteur pipet kullanarak, kısaca 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine zarı yerleştirmeden önce kalan koroid ve kan çıkarmak için ultra saf su ile Bruch membranı durulayın. Herhangi bir bulaşık hücresel madde lize yardımcı olmak için yaklaşık 1 ml ultra saf su ve vorteks kısa bir süre (yaklaşık 15 saniye) 'den hazırlanmaktadır Bruch membran Askıya (bakınız Şekil 2). Membran pelet süpernatant aspire 30 saniye boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Not: daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C ya da depolama (bölümünün altında 2'de tarif edildiği gibi) geri kalan zenginleştirilmiş Bruch membranı çözündürme için hazırdır. Tüm Zenginleştirilmiş Bruch membran ve Western Blot Analizi 2. Çözündürülmesi 500 ul 8 M ur, dokuyu daldırılmasıyla zenginleştirilmiş Bruch zarının proteini ekstrakte1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri (Şekil 3A), oda sıcaklığında 6 saat boyunca ad. 10 dakika boyunca 10.000 xg'de Santrifüj çözünmüş örnekler kalan dışı konuyu pelet. Süpernatantı ve 3500 Da MWCO diyaliz membranına aktarmak ve ardından 4 ° C'de 16 saat boyunca diyaliz PBS 1 L numuneyi. Her numune için, protein izolasyon boncuk 40 ul ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek / boncuk karışımı (bir döner karıştırıcıda 20 rpm) döner. 5 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüjleyin örnekleri boncuk: pelet. (A / h) gliserol a,% 0.01 bromofenol mavisi,% 3 β-mersaptoetanol (65.8 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 2.1 SDS,% 26.3), 30 ul 2x numune yükleme tamponunda boncuklara bağlanan protein Süpernatantı ve çözünür. 10 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin ve 5 dakika geri kalan boncuklar: pelet daha sonra 10,000 x g'de santrifüjlenir. Pre-cast için yayımlanan proteinleri içeren süpernatant yükleyin SDS-Protein ayrımı için sayfa gradyan jeli (malzeme listesine bakınız). Örneğin, ortak bir boyama protokolü, Coomassie mavisi kullanılarak ayrılan protein bantları gözünüzde canlandırın. ((Ağ / hac),% 50 metanol,% 10 glasiyal asetik asit,% 40 su,% 0.1 parlak mavi), jel ve hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Kısaca, parlak mavi leke 20 ml ilave inkübe . Boyama solüsyonu atın ve arka plan renklenmesi yeterli bir boyanmış protein bantını görselleştirme izin inene kadar deiyonize su ile boyanmış jel yıkayın. Aşağıda tarif edildiği gibi Alternatif olarak, aktarma, batı analizi için nitroselüloza protein bandını ayrıldı. Aktarım transfer tampon maddesi içinde yarı kuru transfer cihazı (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 10 [hacim / hacim] metanol) kullanılarak 2,5 saat süre ile 80 mA nitroselüloz zar üzerine protein bantları ayrıldı. 10 ml PBS,% 10 zarı bloke th öncesinde 4 ° C'de 16 saat boyunca süt ve% 0.02 (ağırlık / hacim) BSA (w / v)Protein tespiti için istenen birincil antikor e eklenmesi. Not: Burada bir örnek olarak, Şekil 3C, komplement kaskadı, faktör H-benzeri protein 1 (FHL-1) 'in bir regülatör problanmış üç ayrı donörlerden çözündürüldü Bruch zarının temsili bir immüno-gösterir. 3. Zenginleştirme Makula Bruch Membran Daha önce açıklandığı gibi 1,3 – 1,1 adımları izleyin. NSR hala yerinde iken, merkezi makula bölgesi (Şekil 4) temsil sarı fovea colouration bulun. Steril 6 mm biyopsi yumruk kullanarak, fovea üzerine yerleştirin ve sıkıca makulaya kesilmiş. Yerinde biyopsi yumruk tutulması, temiz bir biyopsi elde etmek için çevredeki göz malzemesini uzak soyma, biyopsi yumruk bıçak kenarına Göz yuvası kenarından bir neşter ile ayrı bir kesi yapmak ve sonra cımbız B'yi kullanarak. Cımbız C kullanarak, kaldırmakTemiz petri kapağındaki yumruk ve yerden doku 6 mm disk. Diseksiyon mikroskobu altında petri kapağı ve maküler yumruk yerleştirin. (Biyopsi doğruluğunu anlaması için sarı fovea boyama kontrol edin) ince NSR diskini çıkarın. Yavaşça RPE hücreleri çıkarmak için steril hücre kazıyıcı kullanın. Cımbız A ipuçlarını kullanarak sklera yoluyla makula diski Güvenli ve yavaş yavaş koroid ve cımbız C. Yine kullanarak Bruch membranı kompleksi soyulabilir, Bruch zarının istenmeyen koroid ve kan madde kaldırmak için hücre kazıyıcı kullanın. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine makula Bruch membranı yerleştirin ve 1 ml ultra saf suda askıya. Vortex kısaca (yaklaşık 15 saniye) herhangi kirletici hücresel konuyu lyse yardımcı olur. Membran pelet süpernatant aspire 30 saniye boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Not: makula izole zenginleştirilmiş Bruch membranı şimdi proteomik An için kullanılabiliralysis kullanıcının tercih ettiği sindirim protokollerini kullanarak.

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokol Bruch membran koriokapillaris ECM izolasyonunda Bruch membranı sonuçlarını zenginleştirilmiş ve RPE dahil olmak üzere tüm hücre / hücre enkaz (Şekil 2) en kaldırır üretmek için. Suda zenginleştirilmiş Bruch membran yıkama kalan koroid hücrelerini parçalayan önemli bir adımdır. Koroid hurdaya sırasında uygulanan basınç Bruch zarının (Şekil 2B) gibi tanımlanmıştır bölgeye birkaç kalan hücre çekirdeklerinin bazıları sıkıştırmak görünmektedir. Zenginleştirilmiş Bruch zarının çözülebilirliği olan protein içeriğinin alt analizini sağlar. 4 kullanarak Bruch membranı zenginleştirilmiş çözünmüş protein bantlarının ayrılması – protein içeriğini tespit etmek kendi başına iken kullanışlı değil% 12 gradyan SDS-PAGE jel, ar kirletici kan proteinleri en aza indirmek için bu tekniğin yeteneğini göstermek yoke spesifik olmayan bağlanma (Şekil 3B). Zenginleştirilmiş Bruch zarının histolojik analizi, Şekil 2 de gösterilen, aynı zamanda destekler: Bu bağlamda, protein jel çalışmadan elde edilen bir önemli devamsız insan serum albumini oldukça büyük bir bant daha sonra başka bir Batı yorumlamak daha zordur blot yapabilir (~ 66 kDa) bir bu. Iş parçası daha önce tarif edildiği gibi 11 Gerçekten de, tek tek donorlarının bir dizi Bruch membranı western lekeleme (Şekil 3C) üzerinden özel antikorlar kullanılarak bir dizi protein için problanmıştır çözündürüldü. Burada gösterilen durumda, (OX23 olarak adlandırılır) bir antikor olarak 12 olarak adlandırılan tamamlayıcı faktör H (FH), kullanılan, doğal bağışıklık bir 155 kDa regülatör karşı yönlendirilen ve ayrı üç ila Bruch membran örnekleri, daha düşük bir molekül ağırlığı bandı varlığını göstermiştir donörler (Şekil 3C). Bu, daha sonra faktör H-benzeri protein 1 olduğu ortaya çıktı (FHL-1)Bir 49 kDa proteini FH ilişkin ve aynı gen 13 bir bağlantı değişiminden kaynaklanan. FHL-1 Bruch zarının 11 ana kompleman düzenleyici mevcut olduğu görülmektedir. Bruch Membran İnsan Gözü ve Zenginleştirme Şekil 1. diseksiyonu. (A) Bruch membranı bir hücre dışı matris engeldir. Koroid (koryokapillaris denir) sürekli Bruch zarı içine birleştirme fenestralı kılcal damarların bir tabaka içerir ve bu fizyolojik fotoreseptör hücreleri destekleyen retina pigment epiteli (RPE) hücre tek tabaka, (büyük kan damarlarını içeren) koroid kalanını ayrı retinada (NSR). (B) insan Göz yuvası içine dört kesi düz bir montaj oluşturmak için açılacak izin yapılan edilmektedir.camsı cımbız kullanılarak çıkarılabilir. NSR vitröz ile birlikte çıkarak aynı zamanda cımbız ile temizlenebilir. Bir hücre kazıyıcı hala koroid ve sklera demirlemiş ise Bruch membran RPE hücre tabakasını kaldırmak için kullanılır. Bruch membranı / koroid kompleksi uzakta sklera soyulmuş olabilir ve yeni bir hücre kazıyıcı kullanarak, dış koroid kaldırılabilir. Ultra saf su içinde nihai yıkama kalan hücresel konuyu lyses. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. ultra saf wa Bruch membran ve yıkama gelen dış koroid yapıları uzakta kazıma Bruch Membran ve (A) daha önce Koroid. H & E boyanan kesitler Histoloji ve sonra (B)ter Bruch membranı zenginleştirilmiş üretir. Ölçek çubukları 20 um temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil Protein içeriği analiz için Zenginleştirilmiş Bruch Membran 3. çözünürlük (A). Protein PBS'ye karşı diyaliz önce, oda sıcaklığında 6 saat süre ile 8 M üre içinde inkübe edilerek zenginleştirilmiş Bruch zarının elde edilebilir. Western analizi için, bütün Bruch membranı diyalizat gelen proteinler protein izolasyon boncuklar kullanılarak izole edilmiş ve elüt Laemmli numune yükleme tamponu indirgeme kaynatılarak. (B) A için temsili Coomassie mavisi hem katışıksız hem de gösteren SDS-PAGE jelini ve Bruch membran çözündürülmüş seyreltilebilir (BM) D Yöntemi kullanılarak. (A) escribed (C) 3 ayrı donörlerden alınan çözülen Bruch membranı bir temsilci western blot (kulvarlar 1-3). faktör H-benzeri protein 1 (FHL-1) için probed büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakam. Macula zenginleştirilmiş Bruch Membran Şekil 4. İzolasyonu. Sarı benek bölgesi 5 mm kolayca örten fovea sarı renklenme ile tespit edilebilir alanı ve komşu optik disk olan yakınlığı. Bir kılavuz olarak foveayı kullanarak, 6 mm makula doku bloğu çıkarılması için, düz monte insan gözü üzerinde 6 mm biyopsi zımbası yerleştirin. Örten NSR çıkarın ve eksize makula gelen RPE hücreleri kazıyın. Kalan Bruch membranı / koroid kompleksi cann uzak sklera soyulmuş olması ve iyice lize ultra saf su içinde dalma hücresel materyal kalan koroid kaldırmak için kazınmış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Burada daha ayrıntılı bir şekilde analizi, batı lekeleme 11, kütle spektrometrisi ve kullanılarak tadil odaları 11,14 Ussing Bruch zarının difüzyon özellikleri dahil olmak üzere sonraki analizler izin vermek için Bruch zarının zenginleştirme tarif eder. Kritik adımlar a) gözün iç yüzeyinin tam bir kazıma ve yıkama Bruch en dağılmasına neden olmayan tüm RPE hücreleri b) altta yatan koroid tekrarlanan ve dikkatli kazıma kaldırmak ve ultra saf su içinde çıkarıldı Bruch en c) yıkanması bulunmaktadır artık hücrelerin parçalanma sağlamak. Zenginleştirilmiş Bruch membranı proteomik analiz için kullanılacak ise Dahası, üre tedavisi ile protein çıkarma gibi mekanik homojenleştirme gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında bu esnek doku kırılmasında en etkin yöntemdir. Zenginleştirilmiş Bruch membran Histoloji koriokapillaris ECM kaldırılmaz gösterir. Bu eski olmaktırpentilaminar Bruch zarının tabaka olarak beklenmeyen koryokapillaris endotelyal hücre temel zarların tarafından oluşturulmaktadır. Gerçekten de değişiklik terminali kompleman kompleksi / membran saldırısı kompleksi (MAC) 15 birikimini içeren AMD bu meydana gibi koroid ECM kalmasını avantajlı olabilir. Bu sklera, koroid ve Bruch zarının mevcudiyetinde kesit halinde Bruch zarının ayrıntılı histolojik analiz için, yapısı daha iyi korunur olacağını belirtmek gerekir. Gerçekten de, Şekil 2 de histoloji yalnızca bu makalede açıklanan teknikle elde edilen takviye derecesinin göstermek için tasarlanmıştır.

Maküler Bruch en zenginleştirme NSR ve özellikle fovea zarar görmezler sağlanması, Göz yuvası dikkatli diseksiyon gerektirir; Aksi takdirde kimlik ve makula dolayısıyla tecrit mümkün değildir. Tissu'nun bütünlüğüe de bu süreçte önemli olduğunu ve bu nedenle 48 saat otopsi zaman altında numuneler kullanılması tavsiye edilir. Gerekli zenginleştirme derecesi bağışçılar arasında değişir ve donör yaşı, postmortem zaman ve herhangi bir göz patolojisi varlığı ile etkilenebilir. Zenginleştirilmiş terimin kullanılması, bu 'arıtma' ya da bu yöntemi kullanarak Bruch membranı 'tecrit' sadece mümkün olmadığını varlık, teknik bir sınırlama kabul kasıtlı olduğunu. Nitekim, koriokapillaris ECM Bruch zarı içine birleştirir verilen orada tam ayrılık mümkün değildir.

İlgili oküler dokularda biyokimyasal değişiklikler anlamak göz hastalığı ilerlemesini anlamak esastır. Bruch membranı Bu benzersiz zenginleştirme bu anlayışı kolaylaştırmaktadır; Devam eden çalışmalar AMD farklı aşamalarında kütle spektrometresi kullanılarak zenginleştirilmiş makula Bruch membranı Proteomun araştırıyorve farklı genotipleri olan kişilerde kaynaklanan örneklerinde AMD moleküler patolojinin anlayışı geliştirmek. Zaten burada açıklanan teknik başarıyla zenginleştirilmiş Bruch zarı üzerinde Bruch membranı 11 ve ileri çalışmalar baskın tamamlayıcısı düzenleyici olarak FHL-1 tanımlamak için kullanılır olmuştur AMD moleküler patoloji içine daha yeni anlayışlar sonuçlanması muhtemeldir.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Dr. Isaac Zambrano ve insan donör göz dokusunda temini için Manchester Göz Hastanesi Göz Bankasında personel ve H & E lekeli görüntüler için Yaşam Bilimleri Histoloji tesisin Fakültesi Mr. Pete Walker kabul etmek istiyorum. Özel teşekkür mikroskobu ile yaptığı yardım için Sayın Roger Meadows gider. SJC Tıbbi Araştırma Konseyi bir alıcı (MAM) Kariyer Geliştirme Bursu (MR / K024418 / 1) ve yazarlar da, MRC (G0900538 ve K004441) diğer son araştırma fonu kabul Sight (1866) ve Makula Toplum için savaşın.

Materials

Auxillary objective 0.5x GT-Vision Ltd 3638 Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6mm Oncall Medical Supplies SCH-33-36 6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin Sigma – Aldrich A3059
Bromophenol Blue Sigma – Aldrich B0126
Cell scrapers Sarstedt 83.183 For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials Sarstedt 72.38
Disposable Scalpels Fisher Scientific 12387999 Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms GT-Vision Ltd 0153 Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma – Aldrich D8537 Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps Scientific Laboratory Supplies INS4280 (A) Fine (100mm) and straight
(B) Forceps Scientific Laboratory Supplies INS4272 (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps Scientific Laboratory Supplies INS4323 (C) Straight fine points
Glycerol Sigma – Aldrich G1345
Glycine Sigma – Aldrich B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software GT-Vision Ltd 1122
Methanol Sigma – Aldrich M/4000/17
Nitrocellulose membrane Life Technologies NP0007
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels Life Technologies NP0322BOX
Petri dish Sterilin 101VR20 90mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin) Agilent 400714-61
SDS Bio-Rad 161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) GT-Vision Ltd 5595 Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl Sigma – Aldrich T3253
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Coleman, H. R., Chan, C. -. C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 372, 1835-1845 (2008).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  3. Coleman, A. L., et al. Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures. Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).
  4. Hageman, G. S., et al. A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).
  5. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 385-389 (2005).
  6. Haines, J. L., et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 419-421 (2005).
  7. Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 421-424 (2005).
  8. Fritsche, L. G., et al. Seven new loci associated with age-related macular degeneration. Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).
  9. Clark, S., Bishop, P. Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration. J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).
  10. Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).
  11. Clark, S. J., et al. Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration. J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).
  12. Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H). Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).
  13. Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. The complete amino acid sequence of human complement factor H. Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).
  14. Moore, D. J., Clover, G. M. The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).
  15. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).

Tags

Age-related Macular DegenerationAMDBruch’s MembraneRetinal Pigment Epithelial CellsRPEDrusenExtracellular MatrixProtein CompositionBiochemical AnalysisMacula

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
McHarg, S., Brace, N., Bishop, P. N., Clark, S. J. Enrichment of Bruch’s Membrane from Human Donor Eyes. J. Vis. Exp. (105), e53382, doi:10.3791/53382 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image