Обогащение мембраны Бруха от глаз человека доноров

Глаз человека ткани согласие для исследовательских целей был получен из Манчестерского Королевского глазной больнице банка глаз после удаления части роговицы трансплантации. Использование человеческой ткани для исследования был в соответствии с Законом о человеческой ткани (2004) руководящих принципов, и с согласия комитета по этике исследовательский университет (ссылка 11305). 1. Обогащение мембраны Бруха Whole Очистите рабочее пространство вокруг и под микроскопом рассекает с 1% дезинфицирующего средства (V / V), а затем протрите 70% (об / об) этанола. Убедитесь, что следующие в руки: один новый одноразовый скальпель, два стерильных скребки клеток (обычно используемые в культуре ткани) и три пары пинцетом (перечисленные здесь, как A, B, и С, увидеть список материалов). Поместите глазного яблока в одноразовый чашки Петри, сохраняя крышку для последующего использования. Используя новый одноразовый скальпель, удалить остатки зрительный нерв, который может помешать созданию плоскую моUNT ткани. Далее, сделать четыре разреза одинаково разнесены, чтобы создать четыре квадранта, если перейти к части 3 (обогащения мембраны Бруха макулярной) не прорезать области макулы. Убедитесь, что разрезы проходят через всю глубину ткани глаза – с внутренней нейросенсорной сетчатки (NSR), через сосудистое и склеры (белок глаза). Продолжить разрез всю дорогу вокруг глаз от края наглазник зрительного нерва. Это позволит наглазник для выровнял (рис 1B). Проведение один квадрант уплощенной наглазник с использованием пинцет A (для предотвращения сосудистое отделение), используйте большие Пинцет B Для захвата стекловидного тела и основной СМП и тянуть эту ткань от пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), начиная с периферии, двигаясь в направлении центра раскрытой наглазником, а затем к противоположной стороне. Обычно, но не всегда так, и стекловидное тело NSR отделить как единое целое. Используйте scalpeл вырезать любой остаточной СМП на якоре в оптическом диске. Опять же, удерживая один квадрант ткани на месте с помощью пинцет A, используют стерильный скребок клеток осторожно сместить НПП монослой со всей внутренней поверхности окуляра. Эти клетки легко отделить и можно рассматривать как темно-коричневый пигмент сгустки. Промыть PBS осторожно смыть падают вниз ПЭС клетки от наглазник. Далее, использовать пинцет, чтобы мягко A шелушиться лежащего темно-красный (ткань, содержащую как мембраны Бруха и сосудистой оболочки) из всех 4 квадрантах глаза. Поместите вырезали ткани в чистую чашку. Использование сплющенный край одной клеточной скребком, чтобы держать вырезали ткани в месте, используйте второй скребок, чтобы мягко очистить ткань. Поверните ткань и повторите, удаляя столько лишнего материала, как это возможно. В конце концов, полупрозрачная мембрана останется: это грубо обогащенный мембраны Бруха. Использование рассекает микроскопом при минимуме 20X увеличении являетсяважное значение в пособничестве удаление сосудистой оболочки и обогащения мембраны Бруха. С помощью пипетки Пастера, кратко промыть мембраны Бруха с особо чистой воды для удаления остатков сосудистую оболочку и кровь до размещения мембраны в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Приостановить обогащенный мембраны Бруха в примерно 1 мл сверхчистой воды и вихрь кратко (приблизительно 15 сек), чтобы помочь лизировать любой загрязняющих клеточной материи (см рисунок 2). Центрифуга образца при 500 мкг в течение 30 сек, чтобы осадить мембраны и аспирации надосадочную. Примечание: Мембрана Остальные Обогащенный Бруха теперь готов к солюбилизации (как описано в разделе 2 ниже) или хранения при -80 ° С для последующего использования. 2. Растворение мембранной и вестерн-блоттинга Whole Обогащенный Бруха Извлечение белка из обогащенной мембраны Бруха, погружая ткани в 500 мкл 8 М урEA в течение 6 ч при комнатной температуре в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках (фиг.3А). Растворенные Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 10 мин для осаждения оставшуюся внеклеточный дело. Удалить супернатант и перенести его на 3500 Да MWCO мембраны диализа, а затем поместить образец в 1 л PBS с диализа в течение 16 ч при 4 ° С. Для каждого образца, добавить 40 мкл белка бисером изоляции, и вращать образец / шарик смеси (20 оборотов в минуту на вращающемся смесителе) при комнатной температуре в течение 30 мин. Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 5 мин для осаждения шариков. Удалить супернатант и растворить белок, связанным с гранулами в 30 мкл 2x загрузки образца буфера (65,8 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (вес / объем) глицерина, 0,01% бромфенол синий, 3% β-меркаптоэтанола). Инкубируйте образцы при 100 ° С в течение 10 мин, а затем центрифуги при 10000 х г в течение 5 мин для осаждения оставшихся шариков. Загрузка супернатант, содержащий высвобожденные белки на к сборных SDS-страница градиент геля (см список материалов) для разделения белков. Представьте разделенных полос белка, используя общий протокол окрашивания, например, кумасси голубой. Вкратце, добавляют 20 мл блестящей синевы (0,1% бриллиантовый синий (вес / объем), 50% метанола, 10% ледяной уксусной кислоты, 40% воды) с гелем, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании , Откажитесь от окрашивания раствор и промыть окрашенные гель с деионизированной водой до тех пор, пока окрашивание фона достаточно снижается для обеспечения визуализации полосы пятнами белка. В качестве альтернативы, передача разделены белковых полос на нитроцеллюлозу для вестерн-анализа, как описано ниже. Передача разделены на полосы белка нитроцеллюлозную мембрану при 80 мА в течение 2,5 ч с использованием аппарата переноса полусухое в буфере передачи (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 10% [объем / объем] метанол). Блок мембраны в 10 мл PBS, 10% (вес / объем) молока и 0,02% (вес / объем) БСА в течение 16 часов при 4 ° С до гое добавление желательных первичных антител для обнаружения белка. Примечание: В качестве примера здесь, 3С показан репрезентативный иммуноблот солюбилизированного мембраны Бруха от отдельных доноров трех зондируют в течение регулятора каскада комплемента, фактора Н-подобного белка (1 FHL-1). 3. Обогащение мембраны Бруха макулярной Выполните шаги 1.1 – 1.3, как описано ранее. Несмотря на то, СМП-прежнему на месте, найти желтую окраску фовеальных, который представляет центральную область макулы (рисунок 4). Используя стерильный 6 мм биопсии удар, поместите его над фовеальной регионе и твердо разрезать на макулы. Поддержание биопсии удар в месте, чтобы отдельный разрез скальпелем с краю наглазником к краю биопсии удар лезвием, а затем с помощью пинцет B, очистить от окружающего материала, чтобы достичь глаза чистой биопсию. Использование пинцет C, удалить6 мм диск ткани от удара и место на чистую чашку крышкой блюдо. Поместите крышку чашки Петри и макулярной удар под микроскопом рассекает. Удалить тонкую NSR диск (проверьте желтого окрашивания фовеальной вывести точность биопсии). Используйте стерильную скребок клеток, чтобы мягко удалить клетки ПЭС. Закрепите макулярной диск с помощью склеры с использованием кончики пинцета А, и медленно снимите сосудистую оболочку и мембранный комплекс Бруха, используя пинцет С. Опять же, использовать мобильный скребок для удаления нежелательных сосудистую оболочку и вещество крови от мембраны Бруха. Поместите мембрану макулярной Бруха в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и приостановить в 1 мл сверхчистой воды. Вихрь кратко (примерно 15 сек), чтобы помочь лизировать любой загрязняющих клеточной материи. Центрифуга образца при 500 мкг в течение 30 сек, чтобы осадить мембраны и аспирации надосадочную. Примечание: Обогащенный мембраны Бруха изолированы от макулы теперь могут быть использованы для протеомики ANalysis помощью предпочтительные протоколы пищеварения пользователя.