Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Menschliche Auge Gewebe zu Forschungszwecken eingewilligt wurde von der Manchester Königlichen Eye Hospital Eye Bank nach dem Entfernen der Hornhaut zur Transplantation erhalten. Die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Human Tissue Act (2004) Richtlinien, mit Zustimmung University Research Ethics Committee (Referenz 11305). 1. Anreicherung von Whole Bruch-Membran Reinigen Sie den Arbeitsbereich um und unter dem Binokular mit 1% Desinfektionsmittel (v / v) und dann wischen Sie mit 70% (v / v) Ethanol. Achten Sie darauf, das Folgende zu Hand: eine neue Einweg-Skalpell, zwei sterilen Zellschaber (üblicherweise in Gewebekultur verwendet werden) und drei Paare von Pinzetten (hier als A, B, und C aufgeführt sind, siehe Materialliste). Setzen Sie die Augenkugel in eine Einweg-Petrischale, Halten des Deckels für die spätere Verwendung. Mit Hilfe einer neuen Einweg-Skalpell, entfernen Sie alle Rest Sehnerv, die stören können mit der Erstellung einer flachen mount des Gewebes. Als nächstes stellen vier Schnitte gleichmäßig beabstandet um vier Quadranten zu erstellen, wenn Sie fortfahren, Teil 3 (Anreicherung von Makula Bruch-Membran) nicht durch die Makula-Region geschnitten. Stellen Sie sicher, dass die Einschnitte erstrecken sich durch die gesamte Tiefe des Augengewebes – vom innersten neurosensorischen Netzhaut (NSR), durch die Aderhaut und Lederhaut (Weiß des Auges). Fahren Sie den Einschnitt den ganzen Weg um das Auge von dem Rand der Augenmuschel des Sehnervs. Damit wird die Augenmuschel aus abgeflacht werden (siehe Abbildung 1B). Halten eines Quadranten des abgeflachten Augenmuschel mit Pinzette A (bis Aderhaut Ablösung zu verhindern), verwenden Sie den größeren Pinzette B zu greifen den Glaskörper und die zugrunde liegenden NSR und ziehen dieses Gewebe aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE), beginnend an der Peripherie, Bewegung in Richtung Zentrum der geöffneten Augenmuschel und dann an der gegenüberliegenden Seite. In der Regel, aber nicht immer beide Glaskörper und NSR lösen als einer. Verwenden Sie die scalpel, um restliche NSR an der Papille verankert herauszuschneiden. Wieder, während, einen Quadranten von Gewebe an Ort und Stelle mit Pinzette A, verwenden Sie den sterilen Zellschaber, um sanft zu entfernen die RPE-Monoschicht von der gesamten Innenfläche der Augenmuschel. Diese Zellen leicht lösen und als dunkelbraun pigmentierter Klumpen zu sehen. Spülen mit PBS vorsichtig waschen weg verdrängt RPE-Zellen aus der Augenmuschel. Als Nächstes verwenden Pinzette A vorsichtig schälen die darüber liegende dunkelrote Gewebe (die sowohl Bruch-Membran und der Aderhaut) von allen 4 Quadranten Auge. Legen Sie die ausgeschnittenen Gewebe in eine saubere Schüssel. Unter Verwendung der abgeflachten Kante von einem Zellschaber, um die herausgeschnittenen Gewebe in Position zu halten, verwenden Sie die zweite Schaber, um sanft kratzen das Gewebe. Drehen Sie das Gewebe über und wiederholen, die Beseitigung so viel überschüssiges Material wie möglich. Schließlich wird eine lichtdurchlässige Membran bleibt: dies ist die grob angereicherten Bruchmembran. Die Verwendung des Präpariermikroskop bei einem Minimum von 20-facher Vergrößerung istunerlässlich bei der Unterstützung der Entfernung der Aderhaut und Bereicherung der Bruch-Membran. Mit einer Pasteurpipette, kurz die Bruch-Membran mit ultrareinem Wasser spülen, um Restaderhaut und Blut, bevor die Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen. Hängen Sie das angereicherte Bruch-Membran in etwa 1 ml Reinstwasser und kurz vortexen (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz (siehe Abbildung 2). Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Die verbleibenden bereichert Bruch-Membran ist nun bereit für die Solubilisierung oder Lagerung bei -80 ° C für die spätere Verwendung (wie in Abschnitt 2 unten beschrieben). 2. Solubilisierung von Whole Enriched Bruch-Membran und Western Blot-Analyse Extrahieren Sie Protein aus angereicherten Bruch-Membran durch Eintauchen des Gewebes in 500 ul 8 M urea für 6 h bei RT in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (3A). Zentrifuge solubilisierten Proben bei 10.000 × g für 10 min, um alle verbleibenden extrazellulären Materie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und überträgt es auf 3.500 Da MWCO Dialysemembran, dann legen Sie die Probe in 1 l PBS zu 16 Stunden bei 4 ° C dialysiert. Für jede Probe werden 40 ul der Proteinisolierung Perlen, und drehen Probe / Perlenmix (20 UpM auf einer rotierenden Mischer) bei RT für 30 min. Zentrifuge Proben bei 10.000 × g für 5 min pelletiert der Wülste. Überstand abnehmen und solubilisieren Proteins an Kügelchen gebunden in 30 ul 2x Probenbeladungspuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) Glycerol, 0,01% Bromphenolblau, 3% β-Mercaptoethanol). Inkubieren der Proben bei 100 ° C für 10 min und dann bei 10.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert werden, um die verbleibenden Kügelchen zu pelletieren. Laden der Überstand, der die freigesetzten Proteine ​​auf einen vorgegossenen enthält SDS-Seite Gradienten-Gel (siehe Materialliste) zur Proteintrennung. Visualisieren getrennten Proteinbanden mit einem gemeinsamen Färbeprotokoll zB Coomassie-Blau. Kurz gesagt, 20 ml des strahlend blauen Fleck (0,1% Brilliantblau (w / v), 50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% Wasser) auf das Gel, und Inkubation für 30 min bei RT unter leichtem Schütteln . Entsorgen Sie die Farblösung und waschen Sie die gefärbten Gels mit entionisiertem Wasser, bis die Hintergrundfärbung ausreichend reduziert, um Buntproteinbande Visualisierung zu ermöglichen. Alternativ Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulose für die Western-Analyse, wie unten beschrieben. Übertragungs getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosemembran bei 80 mA für 2,5 h unter Verwendung halbtrockenen Übertragungsvorrichtung in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 10% [v / v] Methanol). Blockieren der Membran in 10 ml PBS, 10% (w / v) Milch und 0,02% (w / v) BSA für 16 Stunden bei 4 ° C vor the Zugabe der gewünschten primären Antikörper zum Nachweis von Proteinen. Hinweis: Als Beispiel hier zeigt 3C einen repräsentativen Immunoblot solubilisiert Bruch-Membran aus drei verschiedenen Spendern untersucht für einen Regler der Komplementkaskade, Faktor H-like protein 1 (FHL-1). 3. Anreicherung von Makula-Bruch-Membran Führen Sie die Schritte 1,1 bis 1,3, wie zuvor beschrieben. Während die NSR noch vorhanden ist, suchen Sie die gelbe Fovea-Färbung, die das zentrale Makula-Bereich (siehe Abbildung 4) darstellt. Mit einem sterilen 6 mm Stanzbiopsie, legen Sie sie über der fovealen Region und fest schneiden in der Makula. Halten die Biopsie-Stanze an Ort und Stelle, stellen Sie eine separate Inzision mit einem Skalpell aus dem Rand der Augenmuschel an den Rand der Biopsie Stanzmesser, und dann mit Pinzette B, abziehen der umgebenden Augenmaterial, um einen sauberen Biopsie zu erreichen. Verwendung Pinzette C, zu entfernendie 6-mm-Scheibe von Gewebe aus dem Stempel und auf den sauberen Petrischale Deckel. Legen Sie die Petrischale Deckel und Makula-Punch unter dem Binokular. Entfernen Sie die dünne NSR Scheibe (nach gelben Fovea-Färbung, um die Genauigkeit der Biopsie entnehmen). Verwenden Sie eine sterile Zellschaber zur schonenden Entfernung der RPE-Zellen. Sichern Sie die Makula-Disk über der Lederhaut mit den Spitzen der Pinzette ein, und langsam ziehen Sie die Aderhaut und der Bruch-Membran-Komplex mit Pinzetten C. Auch hier verwenden Sie den Zellschaber, um unerwünschte Aderhaut und Blutstoffe aus Bruch-Membran zu entfernen. Legen Sie die Makula-Bruch-Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Aussetzung in 1 ml ultrareinem Wasser. Vortex kurz (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Das angereicherte Bruch-Membran von der Makula isoliert kann jetzt verwendet werden, ein Proteom-alysis mit bevorzugten Verdauung Protokollen des Benutzers.