Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.
年龄相关性黄斑变性(AMD)是在发达国家视力障碍的主要原因。该疾病本身表现由中心视网膜的,称为黄斑的破坏,从而导致中心视力的丧失。早期AMD的特征在于小,淡黄病变称为软脉络膜小疣,可以进步的存在到晚期AMD如地理萎缩(干性AMD)或新血管形成(湿性AMD)。虽然临床变化很好的描述,并赋予AMD风险遗传影响的认识越来越以往任何时候都更加细致,一个领域缺乏重大进展是遗传风险的生物化学后果的认识。这部分是由于难以理解Bruch膜,非常薄的细胞外基质,它作为材料的从血液供给一个生物过滤器和视网膜色素上皮(RPE)细胞单层驻留的一个支架的生物化学。玻璃膜疣˚F内Bruch膜和它们的存在ORM破坏营养流向RPE细胞。仅通过调查Bruch膜的蛋白质组成,而事实上其他蛋白质与它如何交互,可以研究人员希望解开支撑玻璃膜疣形成,发展的AMD和随后的视力丧失的生化机制。本文详细方法用于富集要么整个Bruch膜,或者仅仅从黄斑区,因此,它可用于下游生化分析,并提供了这是如何已经改变Bruch膜生物化学的理解实施例。
在眼科研究中使用的验尸人眼组织对眼睛疾病的发病机制的认识的宝贵资源。人类供体眼分析作出了挑剔的支撑年龄相关性黄斑变性(AMD),这是失明的在西方世界1主要原因机制作出了重要贡献。从全球来看,AMD占所有失明的约8.7%,并与人口日益老龄化,预计影响到1.96亿人,到2020年2,AMD会导致中央视力的丧失,对病人的独立性和生活质量产生深远的影响3。早期AMD的特征在于玻璃疣的形成和它可以发展为地图样萎缩(有时被称为“干”AMD)或脉络膜新生血管形成(也称为新血管或“湿”的AMD)。虽然抗VEGF注射可稳定或改善视力的新生血管性AMD是我不是治愈性,并且在目前,还没有治疗存在地图样萎缩。
虽然某些遗传变型已被示出修改的AMD风险4 – 8,很少有关于这些变体如何影响黄斑在生化水平。在AMD发病的重要站点是Bruch膜。这种结构和各种研究中的玻璃膜疣的形式已经和周围Bruch膜在AMD 9提供补体激活的证据。布鲁赫膜是细胞外基质,从脉络膜分离的视网膜色素上皮(RPE)细胞的片材,并且大约4微米厚。布鲁赫膜并入脉络膜,一层包含有孔的毛细管和外部此脉络膜是含有粗的血管10(图1A)层。
布鲁赫的膜是额外的一个pentilaminar片蜂窝基质(ECM),以及这种方法详述如何隔离Bruch膜,随着底层脉络膜毛细血管的ECM(以下称富含Bruch膜),这在很大程度上是脱细胞,无红血细胞。富布鲁赫的膜,然后用于免疫印迹和组织学实验。此外,方法用于从眼睛的黄斑区域富集Bruch膜仅仅被描述,这将是特别感兴趣的是那些研究的AMD的生物化学方面的。
这里,我们描述Bruch膜的富集进行进一步的分析,允许随后的分析,包括Western印迹11,质谱和Bruch膜的利用改性尤斯灌流室11,14的扩散性质。关键步骤包括:a)眼的内表面的透彻刮削和洗涤以除去所有的RPE细胞b)该底层脉络膜的重复和仔细刮削而不会引起布鲁赫瓦解和的切除布鲁赫c)如超纯水洗涤以确保残余细胞的裂解。此外,如果富集Bruch膜是将要用于蛋白组学分析,蛋白质提取由尿素处理是最有效的在打破该弹性组织相比,其它方法如机械均化。丰富Bruch膜的组织学显示脉络膜的ECM不会被删除。这是恩存在意外作为pentilaminar Bruch膜的外层是由脉络膜毛细血管内皮细胞基底膜形成。事实上,它可能是有利的脉络膜毛细血管的ECM保持为发生变化这在AMD的包括末端补复杂/膜攻击复合物(MAC)15的沉积。应当指出的是,对于Bruch膜的详细的组织学分析,其结构将能更好地保留,如果切片在巩膜,脉络膜,和Bruch膜的存在。事实上, 在图2中呈现的组织学完全是意在展示富集从本手稿中描述的技术产生的程度。
黄斑布鲁赫富集需要小心剥离眼罩,确保NSR和尤其中央凹不受损坏;否则鉴定并因此隔离黄斑是不可能的。该Tissu酒店的完整性e是同样重要的是这个过程,它因此,建议使用下48小时验尸时间样本。需要富集的程度捐助者之间的变化,并且可受供体年龄,验时间,以及任何眼睛病理的存在。利用丰富的术语是故意在确认该技术的限制,这是那个'净化'或Bruch膜的使用这种方法'隔离'根本是不可能的。事实上,由于脉络膜的ECM并入Bruch膜有完全分离是不可行的。
理解的各眼组织的生化改变是在了解眼睛疾病进展至关重要。 Bruch膜的这种独特的丰富有利于这种认识;正在进行的研究是用质谱在AMD的不同阶段,研究丰富了黄斑布鲁赫的膜蛋白质组并在样本从受试者不同基因型始发改善的AMD的分子病理学的理解。已经在这里描述的技术已成功地用于鉴定FHL-1作为在上富集Bruch膜Bruch膜11,并进一步研究的主要补体调节器可能导致更多的新的见解的AMD的分子病理学。
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢艾萨克·桑布拉诺博士及其工作人员在曼彻斯特眼科医院眼库的人供体眼组织的供应,以及生命科学组织学机构为H&E染色图像学院的皮特·沃克先生。特别感谢罗杰·梅多斯先生对他的帮助与显微镜。 SJC是一个医学研究理事会的接受者(MRC)职业发展奖学金(MR / K024418 / 1),作者也承认,从MRC(G0900538和K004441)等近期的研究经费,争取视力(1866年)和黄斑社会。
Auxillary objective 0.5x | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
Biopsy Punch 6mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
Bovine serum albumin | Sigma – Aldrich | A3059 | |
Bromophenol Blue | Sigma – Aldrich | B0126 | |
Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma – Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
(A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100mm) and straight |
(B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample |
(C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
Glycerol | Sigma – Aldrich | G1345 | |
Glycine | Sigma – Aldrich | B0126 | |
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
Methanol | Sigma – Aldrich | M/4000/17 | |
Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90mm, used as a dish for samples |
Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T3253 |