إثراء غشاء بروك من عيون المانحة الإنسان
Summary
Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.
Abstract
الضمور البقعي (AMD) المرتبطة بالعمر هو السبب الرئيسي لضعف البصر في العالم المتقدم. المرض يظهر نفسه من خلال تدمير مركز الشبكية، وتسمى البقعة، مما أدى إلى فقدان الرؤية المركزية. يتميز AMD في وقت مبكر من وجود آفات صفراء صغيرة تسمى براريق شفافة لينة يمكن أن تقدم على أواخر AMD مثل ضمور الجغرافي (تجف AMD) أو neovascularisation (AMD الرطب). على الرغم من التغيرات السريرية وصفا جيدا، وفهم التأثيرات الجينية على منح خطر AMD هي الحصول على أي وقت مضى أكثر تفصيلا، منطقة واحدة تفتقر تقدما كبيرا هو فهم العواقب البيوكيميائية من المخاطر الجينية. ويرجع هذا جزئيا إلى صعوبات في فهم الكيمياء الحيوية للغشاء بروك، مصفوفة خارج الخلية رقيقة جدا أن تعمل كمصفاة البيولوجي من المواد في إمدادات الدم وسقالة الذي الشبكية الصبغية الطلائية (RPE) أحادي الطبقة خلية يقيم هذا. براريق شفافة ومكتب إدارة السجلات داخل غشاء بروك وجودهم يعطل تدفق المغذيات إلى الخلايا RPE. فقط من خلال التحقيق في تكوين البروتين من الغشاء بروك، بل وكيف تتفاعل البروتينات الأخرى مع ذلك، يمكن أن يأمل الباحثون لكشف الآليات البيوكيميائية التي تعزز تشكيل براريق شفافة، وتطوير AMD وفقدان الرؤية لاحقة. تفاصيل هذه الورقة منهجيات لتخصيب إما الغشاء كله بروك، أو فقط من منطقة البقعة، بحيث يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية المصب، وإعطاء أمثلة عن كيف أن هذا بدأ يتغير بالفعل فهم الكيمياء الحيوية غشاء بروك.
Introduction
استخدام ما بعد الوفاة أنسجة العين البشرية في مجال البحث في طب العيون هو مصدرا قيما لفهم المرض والتسبب في العين. جعلت تحليل العينين المانحة الإنسان مساهمات هامة لالمميزين الآليات التي تقوم عليها، الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، والذي هو السبب الرئيسي للعمى في العالم الغربي 1. على الصعيد العالمي، وحسابات AMD لحوالي 8.7٪ من مجموع العمى ومع شيخوخة السكان على نحو متزايد، ومن المتوقع أن تؤثر على 196 مليون شخص بحلول النتائج 2020 2. AMD في فقدان الرؤية المركزية، ولها تأثير عميق على الاستقلال المريض ونوعية الحياة 3. يتميز AMD في وقت مبكر من تشكيل براريق شفافة ويمكن ان يتطور الى ضمور الجغرافي (يشار إليها أحيانا باسم "الجاف" AMD)، أو اتساع الأوعية الدموية المشيمية (كما يشار إلى حديث التوعي أو "الرطب" AMD). بينما لمكافحة VEGF الحقن يمكن أن تستقر أو تحسين الرؤية في التوعية المستحدثة AMD هو أناليست علاجية، وفي الوقت الحاضر، لا يوجد علاج لضمور الجغرافي.
بينما ثبت بعض المتغيرات الجينية لتعديل خطر AMD 4-8، لا يعرف الكثير عن كيفية تأثير هذه المتغيرات على البقعة على مستوى الكيمياء الحيوية. موقع مهم في AMD المرضية هو غشاء بروك. وقد وفرت شكل براريق شفافة داخل هذا الهيكل والدراسات المختلفة دليل على تفعيل مكمل في وحول غشاء بروك في AMD 9. غشاء بروك هو ورقة من المصفوفة خارج الخلية الذي يفصل بين الشبكية الصبغية الطلائية (RPE) الخلايا من المشيمية، وحوالي 4 ميكرون سميكة. يندمج غشاء بروك في المشيماء الشعيرية، وطبقة من المشيمية التي تحتوي على الشعيرات الدموية منوفذة والخارجية لهذا هي طبقات تحتوي على الأوعية الدموية الكبيرة 10 (الشكل 1A).
غشاء بروك هو ورقة pentilaminar من خارجمصفوفة الخلوية (ECM)، وهذه المنهجية تفاصيل كيفية عزل غشاء بروك، جنبا إلى جنب مع ECM من المشيماء الشعيرية الأساسية (المشار إليه التخصيب غشاء بروك)، وهو decellularized إلى حد كبير وخالية من خلايا الدم الحمراء. ثم تم استخدام غشاء المخصب بروك لغرب النشاف والأنسجة التجارب. وعلاوة على ذلك، وصفت منهجية لتخصيب غشاء بروك فقط من منطقة البقعة من العين، والتي سوف تكون ذات أهمية خاصة لتلك التي تحقق في الجوانب الحيوية من AMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف إثراء غشاء بروك لمزيد من التحليل السماح التحليلات اللاحقة بما في ذلك النشاف الغربي 11، مطياف الكتلة وخصائص انتشار غشاء بروك الاستفادة تعديل Ussing غرف 11،14. وتشمل الخطوات الحاسمة أ) تجريف شامل وغسل السطح الداخلي للعين لإزالة جميع RPE الخلايا ب) تجريف المتكررة ودقيق للالمشيمية الكامنة دون التسبب في بروك في التفكك وج) غسل في بروخ رفعه في الماء عالى النقاء لضمان تحلل الخلايا المتبقية. وعلاوة على ذلك، إذا غشاء بروك المخصب هو لاستخدامها لتحليل البروتين، واستخراج البروتين عن طريق العلاج اليوريا هو الأكثر فعالية في كسر هذا النسيج مرونة بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل تجانس الميكانيكية. الأنسجة من غشاء المخصب بروك يشير لا يتم إزالة ECM من المشيماء الشعيرية. هذا هو أن تكون السابقينيتم تشكيل pected والطبقة الخارجية من غشاء pentilaminar بروك التي المشيماء الشعيرية البطانية الأغشية الطابق السفلي الخلية. والواقع أنه قد يكون من المفيد أن ECM من المشيماء الشعيرية يبقى كما تحدث تغييرات في هذا في AMD بما في ذلك ترسب تكملة محطة مجمع مجمع / هجوم غشاء (MAC) 15. وتجدر الإشارة إلى أن للتحليل النسيجي مفصل لغشاء بروك، وهيكلها سيتم الحفاظ على أفضل إذا مقطوع في وجود الصلبة، المشيمية، وغشاء بروك. والواقع أن الأنسجة المعروضة في الشكل 2 يهدف فقط للتدليل على درجة تخصيب الناتجة عن تقنية الموضحة في هذه المخطوطة.
إثراء البقعي في بروخ يتطلب تشريح دقيق للفنجان العين، وضمان أن NSR وخصوصا النقرة لا تلف. خلاف ذلك تحديد وبالتالي عزل البقعة ليست ممكنة. سلامة TISSUالبريد مهم أيضا في هذه العملية، وبالتالي فمن المستحسن أن العينات تحت 48 ساعة مرة بعد الوفاة استخدامها. درجة التخصيب المطلوبة تتراوح ما بين الجهات المانحة ويمكن أن تتأثر سن المانحة، والوقت بعد الوفاة، ووجود أي أمراض العين. استخدام مصطلح المخصب متعمد في الاعتراف جود قيود على هذه التقنية، وهذا هو أن "تنقية" أو "العزلة" غشاء بروك استخدام هذا الأسلوب هو ببساطة غير ممكن. في الواقع، بالنظر إلى أن ECM من المشيماء الشعيرية يندمج غشاء بروك هناك فصل كامل غير ممكن.
فهم التغيرات البيوكيميائية للأنسجة العين منها أمر أساسي في فهم تطور المرض العين. هذا تخصيب فريد من غشاء بروك يسهل هذا الفهم. الدراسات الجارية تحقق في بروتيوم من البقعي المخصب غشاء بروك باستخدام مطياف الكتلة في مراحل مختلفة من AMDوفي العينات القادمة من الموضوعات مع الأنماط المختلفة لتحسين فهم علم الأمراض الجزيئي للAMD. إذا تم استخدام تقنية الموضحة هنا لتحديد بنجاح FHL-1 كمنظم لتكملة السائد في غشاء 11 و مزيد من الدراسات بروك على غشاء المخصب بروك من المرجح أن يؤدي إلى المزيد من الأفكار الجديدة في علم الأمراض الجزيئي للAMD.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف الدكتور إسحاق زامبرانو والموظفين في العين بنك مانشستر مستشفى العيون لتوريد أنسجة العين المانحة البشري، والسيد بيت ووكر كلية مرفق علوم الحياة الأنسجة للصور H & E الملون. شكر خاص يذهب إلى السيد روجر ميدوز لمساعدته مع المجهري. مجلس القضاء الأعلى هو المستفيد من مجلس البحوث الطبية زمالة التنمية (MRC) الوظيفي (MR / K024418 / 1) والكتاب كما يقر تمويل البحوث التي أجريت مؤخرا غيرها من MRC (G0900538 وK004441)، الكفاح من أجل البصر (1866) وجمعية البقعي.
Materials
| Auxillary objective 0.5x | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
| Biopsy Punch 6mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
| Bovine serum albumin | Sigma – Aldrich | A3059 | |
| Bromophenol Blue | Sigma – Aldrich | B0126 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
| CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
| Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
| Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma – Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
| (A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100mm) and straight |
| (B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample |
| (C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
| Glycerol | Sigma – Aldrich | G1345 | |
| Glycine | Sigma – Aldrich | B0126 | |
| GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
| Methanol | Sigma – Aldrich | M/4000/17 | |
| Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
| Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90mm, used as a dish for samples |
| Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T3253 |
Riferimenti
- Coleman, H. R., Chan, C. -. C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 372, 1835-1845 (2008).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Coleman, A. L., et al. Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures. Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).
- Hageman, G. S., et al. A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 385-389 (2005).
- Haines, J. L., et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 419-421 (2005).
- Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 421-424 (2005).
- Fritsche, L. G., et al. Seven new loci associated with age-related macular degeneration. Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).
- Clark, S., Bishop, P. Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration. J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).
- Clark, S. J., et al. Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration. J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).
- Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H). Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).
- Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. The complete amino acid sequence of human complement factor H. Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).
- Moore, D. J., Clover, G. M. The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).
