フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
インフルエンザAウイルス（IAV）のエントリは、標的細胞1の細胞膜上の受容体へのウイルスの結合で開始する多段階プロセスです。 IAVの受容体は、糖タンパク質および糖脂質の多種多様に存在するシアル酸です。ウイルスエンベロープ中に存在するIAVのヘマグルチニン（HA）タンパク質は、シアル酸に結合し、それによって標的細胞2の原形質膜へのウイルス粒子の付着を媒介します。ウイルスは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して細胞に入るだけでなく、マクロピノサイトーシスなどの代替エントリー経路は、3-6に記載されています 。 HAとシアル酸との間の相互作用は、付着およびウイルス粒子7の内在化をトリガ両方を媒介するのに十分であるように見えます。それにもかかわらず、代替エントリー受容体が提案されているとIAVエントリにおける役割は、現在、1,8,9を検討されています。
CURrently、努力が緊急に必要とされる、新規な抗ウイルス治療法10-12開発を目的としたウイルスのライフサイクルに関与する宿主因子を同定するために行われます。ウイルス侵入は、その最も早い時点でウイルス感染を阻止するために、IAV増殖を標的とするための有利なステップになります。ウイルスの通常大量の着信ウイルスを検出するために必要とされる実験IAVエントリの異なる段階を測定することは困難です。加えて、ウイルス侵入の変化の検出範囲のみによりウイルス複製の欠如に線形です。これは、高感度のアッセイのための必要性を強調する。
ここで本発明のアッセイは、細胞表面に付着したウイルスの検出ならびに細胞関連ウイルスの合計量に対する内在ウイルスの検出を可能にします。ビオチン化野生型ウイルスの使用は、STV-Cy3およびフローサイトメトリーによる読み出しに染色を通じて便利な測定を可能にします。ビオチン化ウイルスは、細胞に冷結合していますSを付着させるが、ウイルス粒子の内在化を防止することができます。細胞は、固定された透過性および添付のウイルスを測定するために、STV-Cy3で染色することができます。ブロッキング工程は、細胞が非標識ストレプトアビジン（STV）と一緒にインキュベートされた固定の前に適用される場合、細胞外、添付ビリオンからの信号を排除することができます。次のステップでは、ビオチン化IAVの取り付け後、温度を37℃にシフトされ、ウイルス粒子の内部移行を行わせます。内在粒子は、それによって細胞外および細胞内のウイルスとの識別を可能STVの結合から保護されています。
実験条件ごとに、4つのサンプルが必要とされている：「0分」：最初のサンプルは、標識された「0分」、細胞表面で冷間結合ウイルスを測定することです。 「0分+ STV '：' 0分+のSTV「標識された第二のサンプルは、実験のベースライン信号強度を与えます。添付ウイルスはウィットをブロックされていますSTV-Cy3で染色以下の時間STVと信号が「0分」のサンプルと比較してはるかに低いことが必要です。 '30分 '：第三のサンプル、'30分'が原因で30分間、37℃に温度シフトに取り付けられ、ウイルスを内在化含まれています。 '30分+ STV '：第4のサンプル、'30分+ STV」対策ウイルスの細胞内画分。 STVブロッキング工程は、30分のインキュベーション期間の後に適用されます。その結果、細胞表面でのウイルス粒子は、STV-Cy3で染色するための唯一の内在化ウイルスは、利用可能な脱離STVによって結合されます。内在化ウイルスの相対的な量は、「（サンプル'30分によって記述）ウイルスの総量で割った（サンプル'30分+ STVで測定される）「内在ウイルスの比として計算することができます。
コントロールとして、我々はモック感染した細胞を含むことを示唆しています。モック感染細胞のSTV-Cy3の染色以下の信号はバックグラウンドを提供します染色プロトコルに起因します。 IAV結合のためのコントロールは、細菌ノイラミニダーゼ（NA）を用いた細胞の前処理です。細胞性糖タンパク質からシアル酸をオフNAを切断し、それによって細胞表面から付着受容体を除去します。アジ化ナトリウム（SA）は、強力な代謝阻害剤であり、それによって、ブロックが13をエンドサイトーシス。アジ化ナトリウムで処理した細胞は、内在化のための結合ウイルスに陽性であるが負でなければなりません。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーにより、ウイルスの付着および内在化を測定する簡単な方法を説明します。これは、ウイルス様粒子（VLP）の使用と比較して、より厳密に模倣ウイルス感染標識野生型ウイルスの使用を可能にします。我々のプロトコルは、IAVの付着および内在化を測定するために最適化されているが、容易に他のウイルスに適合させることができます。フロー?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、のSStにスイス国立科学財団（31003A_135278）からの助成金によってサポートされていました。 MOPはAXA研究基金から博士助成金の受益者です。我々は、 図1の設計のヘルプはパトリシア・ニグに感謝します。
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
Riferimenti
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virolog. 2, (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G., Macey, M. G. . Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
