Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
Come nanomateriali sono sempre più utilizzati in una varietà di settori e applicazioni, vi è la necessità per nanoscala di imaging e caratterizzazione metodi che sono più rapidi, economico e conveniente di modalità tradizionali, come la microscopia elettronica. Per visualizzare nanoparticelle (NP) interazioni con le cellule, i tessuti e sistemi viventi, sono state impiegate molte tecniche ottiche, tra cui contrasto interferenziale differenziale (DIC) Microscopia 1 e approcci sul campo evanescenti, come riflessione interna totale (TIR) o Vicino- microscopia a scansione campo ottico (NSOM) 2,3. Tuttavia, questi sono approcci analitici di fascia alta, fuori dalla portata della maggior parte dei laboratori non specializzati 4. La microscopia elettronica, compreso microscopia elettronica a trasmissione (TEM), è stato utilizzato anche per studiare l'interazione con le cellule NP 5,6,7,8. Angolo alto anulare campo oscuro (HAADF) microscopia elettronica a scansione trasmissione è stato utilizzato per studiare l'interazione di NPcon i virus 9. La microscopia confocale è un'altra tecnica popolare usato per studiare le interazioni NP-cellula 10.
Negli ultimi anni, l'imaging iperspettrale (HSI) tecniche basate campo scuro-sono stati utilizzati come strumento di analisi promettente per lo studio nanoparticelle in matrici biologiche 11. Sistemi HSI generano una rappresentazione tridimensionale di dati spaziali e spettrali, noto come un ipercubo o DataCube 12. La mappa spaziale di variazione spettrale viene utilizzato per l'identificazione dei materiali. Profili spettrali di materiali noti possono essere generati e utilizzati come librerie di riferimento per il confronto con campioni sconosciuti. Uno dei principali vantaggi con sistemi HSI è la sua capacità di combinare l'imaging con spettroscopia, così da stabilire la posizione e distribuzione delle NP sconosciuti in vivo o ex vivo e collegandoli a un'altra particella di riferimento noto, composizione simile.
Ci sono diversi vantaggi dil'utilizzo di sistemi HSI su tecniche di imaging convenzionali: è richiesta una minima preparazione del campione; preparazione del campione è in genere non distruttivo in natura; l'acquisizione delle immagini e l'analisi è più veloce; la tecnica è conveniente 13; e la distribuzione spaziale e l'analisi di composti di composizione mista e / o in matrici complesse è più facilmente realizzabile 14.
Per ricerche nanomateriali coinvolgono campioni preziosi, una delle considerazioni più importanti è la disponibilità di un metodo di imaging non distruttivo, che consente la possibilità di esaminare ripetutamente campioni di uno o più metodi. Ripetuti o più analisi possono desiderare di sviluppare set di dati globali che non sarebbero disponibili da un unico metodo. A questo proposito, studiando le sue proprietà ottiche è il modo più sicuro per analizzare il campione. Utilizzando un microscopio potenziato darkfield (EDFM) e sistema HSI per studiare la risposta ottica del campione – cioè Reflectance, ma anche di assorbanza e trasmittanza – l'identificazione e la caratterizzazione caratteristica può essere effettuata 15. I potenziali endpoint caratterizzazione includono una valutazione della dimensione relativa e la forma di nanoparticelle o agglomerati e distribuzione di nanoparticelle all'interno di un campione.
In questo articolo, descriviamo metodi di mappatura specificamente per le nanoparticelle di ossido di metallo nel tessuto post mortem utilizzando un sistema HSI basato su un algoritmo partita pixel spettrale indicato come un mappatore angolo spettrale (SAM). Abbiamo scelto questa particolare applicazione, perché ha il potenziale per integrare attuale e futuro nella ricerca nanotossicologia vivo, in cui i modelli animali sono utilizzati per valutare le implicazioni sulla salute dell'esposizione ai nanomateriali ingegnerizzati. L'applicazione di questo metodo potrebbe anche informare ricerca di somministrazione di farmaci su scala nanometrica che utilizza modelli di tessuto o animali. In particolare, l'assorbimento di nanoparticelle, distribuzione, metabolismo e l'escrezione tutto organs e tessuti possono essere indagati con questo sistema. Un'ampia varietà di applicazioni sono in fase di studio per l'uso nella ricerca biomedica 11.
Questo metodo potrebbe essere utilizzato per la valutazione di diversi campioni biologici (ad esempio vari tipi di tessuti, campioni di lavaggio broncoalveolare, e strisci di sangue), che sono stati esposti alle nanoparticelle di una varietà di composizioni elementari 16-19. Inoltre, questo metodo è utile per studiare nanoparticelle biodistribuzione in vivo e in vitro, che è pertinente per studi drug delivery nanoscala 11. Oltre campioni biologici, EDFM e HSI possono essere utilizzati per valutare nanoparticelle in campioni ambientali, come acqua di scarico 20. Valutazione dell'esposizione professionale può essere facilitata mediante l'uso di questa tecnica e, in quanto può essere utilizzato per valutare l'efficacia dei dispositivi di protezione individuale per la prevenzione di penetrazione delle nanoparticelle. Inoltre, la ricerca team sta attualmente sviluppando un EDFM simile e il protocollo HSI per la valutazione dei campioni dei media filtranti di nanoparticelle raccolti da valutazioni di esposizione professionale. Mentre preparazione di questi diversi tipi di campioni per EDFM e HSI può variare, è importante che siano preparati in modo tale che essi possono essere facilmente visualizzate dal sistema ottico. In genere, il campione deve essere preparato come se fosse essere visualizzato tramite la microscopia in campo chiaro tradizionale. Ci sono diversi sistemi di imaging iperspettrale disponibili in commercio 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per i campioni di tessuto che sono stati sottoposti a colorazione istologica convenzionale, l'identificazione e l'analisi di metalli nanoparticelle di ossido possono essere realizzati attraverso una combinazione di EDFM, mappatura HSI, e tecniche di analisi di immagine. Mentre vi è la flessibilità nella preparazione dei campioni per l'esame istologico o immunoistochimica (ad esempio, utilizzando tessuti fissati o congelati; tipo di macchia), è importante che i campioni sono sezionate ad uno spessore di 5-10 micron per la visualizzazione ottimale. I campioni utilizzati qui sono stati fissati in formalina e incluso in paraffina prima di sezionamento con un microtomo rotativo di 6 micron di spessore, montati su vetrini per microscopio, macchiato con ematossilina eosina e coprioggetto. Tessuti della pelle suina da un cutaneo collaborazione ex vivo penetrazione di tossicologia sono stati utilizzati per questo studio. I tessuti sono stati esposti a nanoparticelle di ossido di metallo (allumina, silice, cerio) in sospensioni acquose. Rilevazione della regione (s) di interesse (eleme alto contrastonti) con EDFM è un primo passo importante che facilita la successiva mappatura e l'analisi HSI. Campioni di controllo positivi e negativi devono essere esposte e analizzati in primo luogo per creare una libreria spettrale per riferimento. Gli spettri raccolti dal controllo positivo sono esportati in una libreria spettrale controllo positivo. Quindi, tutti gli spettri dalle immagini di controllo negativo sono sottratti dalla biblioteca spettrale del controllo positivo per migliorare la specificità (ridurre i falsi positivi). La libreria spettrale filtrato risultante è considerato il RSL che serve per l'analisi di materiali di interesse. Tutti i campioni di tessuto subiscono lo stesso processo di imaging e vengono mappate contro il RSL. L'immagine risultante conterrà solo le aree con elementi di interesse su uno sfondo nero. Questa immagine potrebbe quindi essere analizzato con ImageJ utilizzando le sue funzioni di soglia e di analisi di particelle per ottenere l'area di particelle mappati per campo. I dati numerici ottenuti da ImageJ può essere esportazionecato di un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
È importante considerare che come campioni biologici sono intrinsecamente diversi l'uno dall'altro, e metodi di colorazione possono influenzare visualizzazione tramite EDFM e HSI, le impostazioni di esposizione devono essere determinati conformemente a quanto produce la migliore immagine ad alto contrasto per un tipo specifico di campione. Sebbene la riduzione di falsi positivi può essere raggiunto attraverso la filtrazione di librerie spettrali, è fondamentale avere controlli negativi affidabili che hanno evitato la contaminazione con l'elemento di interesse, come spettri corrispondente a tale contaminazione potrebbe potenzialmente essere filtrata dalla libreria spettrale del controllo positivo , aumentando i tassi di falsi negativi. Inoltre, la gamma di intensità spettro che è rilevabile con il software di imaging iperspettrale non può superare il limite del software particolare (per questo studio, cioè 16.000 unità): aree con un elevato numero di particelle accumulate che producono spintensità ectral superiori al limite di intensità sono lasciati fuori della biblioteca spettrale, a causa del rischio di aumentare il numero di falsi negativi.
Mentre il sistema HSI conferisce molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, ci sono alcuni svantaggi e limitazioni da considerare. Una è che la grande quantità di dati ottici raccolti possono richiedere potenza di calcolo notevole. Un altro è che HSI può essere ad alta intensità di tempo, in particolare nelle fasi iniziali, quando si creano librerie spettrali di riferimento. Inoltre, il tempo di imaging può richiedere diversi minuti per l'acquisizione di immagini, il che rende più lento di semplice di imaging in campo oscuro; tuttavia, è ancora più veloce di eseguire la preparazione del campione e la visualizzazione al microscopio elettronico. Inoltre, i sistemi complessi possono comportare molteplici spettri caratteristici, che richiedono lo sviluppo di controlli altamente specializzati e rendono la creazione di librerie di riferimento, universali standardizzate difficili 26. Infine, la tecnologiarisultati nique a risoluzione inferiore rispetto alle tecniche probe- o microscopia elettronica, come la microscopia a forza atomica o microscopia elettronica a trasmissione, che possono risolvere i singoli atomi. Risoluzione di questa tecnica è limitata a causa della sua natura fotonica, che impedisce di essere uno strumento di alta precisione per misurare dimensioni delle particelle a livello nanometrico o per localizzare con precisione materiali ad un livello sub-micron. Mentre la tecnica può essere in grado di individuare particelle entro certi compartimenti o organelli cellulari maggiore di 1 micron (come nuclei delle cellule), organelli piccole o caratteristiche sono difficili da visualizzare accuratamente con questo metodo. Da notare anche, data la sua risoluzione spaziale, questo metodo non può distinguere tra singole nanoparticelle e agglomerati 11.
Altre considerazioni includono: alcuni materiali (come i metalli nobili) hanno molto più elevata riflettanza e profili spettrali distinti, che possono renderli più facilmente analyze e mappa spettralmente con questo strumento. Altri, come gli ossidi metallici semi-esaminati in questo studio e nanomateriali a base di carbonio 24, 27, può essere più difficile a causa della loro composizione elementare, la forma e seconda matrice. In due studi di inalazione murini di Mercer et al., Un sistema simile a quello impiegato in questo studio è stato usato al fine di individuare i nanotubi di carbonio nei polmoni e negli organi secondari in base al loro notevolmente alto contrasto con i tessuti circostanti. Tuttavia, la mappatura iperspettrale non è stata dimostrata in uno studio, probabilmente perché la forma unica di fibre di carbonio era un tratto sufficiente per l'identificazione. Un'altra considerazione riguarda specificamente ai tessuti: dal deposito di nanoparticelle di interesse di organi specifici attraverso normali processi biofisici è imprevedibile (e spesso si oggetto di studio), la determinazione di un controllo positivo applicabile può essere difficile e richiede la considerazione di come la generazione del controllo mIRITTO influenzare lo stato di un materiale di interesse. Ad esempio, se una libreria spettrale è creata da nanoparticelle cristalline di interesse, può essere difficile per mappare la libreria di quelle stesse nanoparticelle in tessuti o cellule a causa di cambiamenti negli spettri derivanti da alterazione della particella (ad esempio, per effetto del cambiamento pH, la dissoluzione, agglomerato, legame con le proteine) e il microambiente generale o matrice. Infine, la tecnica è limitata nella sua natura semi-quantitativa: può essere solo quantitativa come altre tecniche di microscopia bidimensionale di risoluzione simile, che significa che non può essere facilmente utilizzato per eseguire operazioni quali caratterizzano onere organo totale di un materiale.
Nel complesso, EDFM e HSI offre numerosi vantaggi rispetto alle tecniche di imaging nanomaterial e caratterizzazione convenzionali, quali TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permette per l'acquisizione e l'analisi delle immagini più veloce, che consente di risparmiare tempo e costi rispetto a più conven intensivaTecniche nali. Inoltre, la preparazione del campione per EDFM / HSI è tipicamente sia minima e non distruttivo, che consente di risparmiare tempo e permette anche per analisi più flessibile di un dato campione in quanto può essere utilizzato per altre tecniche. Inoltre, HSI è versatile, consentendo analisi dei materiali nanoscala di molte composizioni e in una varietà di matrici. Il team di ricerca sta lavorando per perfezionare il metodo descritto qui per altri materiali e tipi di campione, compresa una valutazione approfondita della specificità della tecnologia. Un passo successivo critico sotto inchiesta da parte del gruppo di ricerca è la convalida di queste tecniche contro gold standard tradizionali (ad esempio, Raman, TEM, SEM) per i materiali e tipi di tessuto di interesse.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
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