Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
La capacité à sécréter des cytokines rapidement lors d'une stimulation est une caractéristique fonctionnelle de l'invariant T tueuses naturelles (iNKT) lignée cellulaire. iNKT cellules sont donc caractérisées par une population de cellules T capables d'activer innée et adaptative direction réponses immunitaires. Le développement des techniques améliorées pour la culture et l'expansion des cellules iNKT murins facilite l'étude de la biologie des cellules iNKT di vitro et dans des modèles in vivo. Nous décrivons ici un procédé optimisé pour l'isolement et l'expansion de cellules spléniques murines iNKT.
Les rates de souris C57BL / 6 sont supprimés, disséqués et tendues et la suspension cellulaire obtenue est en couches sur les médias de gradient de densité. Après centrifugation, les cellules mononucléaires spléniques (EMN) sont recueillies et (CD5 +) des lymphocytes CD5-positifs sont enrichies en utilisant des billes magnétiques. iNKT cellules au sein de la fraction CD5 + sont ensuite colorées avec du ^5; GalCer tétramère CD1d-chargé et purifié par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Triées par FACS des cellules iNKT sont initialement puis cultivées in vitro en utilisant une combinaison de cytokines murines recombinantes et des récepteurs des cellules T de plaque lié (TCR) des stimuli avant d'être détendu dans la présence de murine IL-7 recombinante. En utilisant cette technique, environ 10 8 cellules iNKT peuvent être générés à l'intérieur de 18-20 jours de culture, après quoi ils peuvent être utilisés pour des tests fonctionnels in vitro, ou in vivo pour les expériences de transfert chez la souris.
Introduction
Murine T (iNKT) les cellules tueuses naturelles invariant constituent une population distincte de lymphocytes T innées choisis dans le thymus thymocytes corticaux par CD1d exprimant 1,2. cellules iNKT expriment un récepteur de lymphocyte T (TCR) comprenant une chaîne Vα14-Jα18 TCR invariant associé à chaque Vß8, Vβ7 ou Vβ2 TCR 3, qui est capable de reconnaître endogène ainsi que des antigènes lipidiques étrangers dans le cadre de CD1d. Par exemple, des cellules murines reconnaissent iNKT et sont activées par un antigène lipide endogène appelé isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, ainsi que les α-galactosylcéramide (aGalCer) 5,6, un glycolipide isolé à partir d'éponges marines. TCR-dépendante de l'activation des cellules iNKT favorise l'amorçage de réponses immunitaires adaptatives, et, par conséquent, les cellules iNKT se sont révélés être fonctionnellement impliquée dans le développement ou l'amélioration d'une gamme de pathologies, y compris les maladies rhumatismales 7 et le cancer <sup> 8. Actuellement, les ligands de cellules iNKT synthétiques constituent de nouveaux prometteurs adjuvants de vaccins qui peuvent être capables de réguler un nombre de conditions immunopathologiques.
Il a précédemment été démontré que les cellules iNKT peuvent être générés in vitro après isolement à partir de tissus de souris toutefois; bon nombre de ces études emploient l'utilisation de cellules primaires présentatrices d'antigène (CPA) et / ou des lignées cellulaires 9, Vα14 TCR transgénique (Tg) de 10 souris, les thymomes ou pour la génération d'hybridomes dérivés de cellules iNKT-11,12. En outre, un grand nombre de souris, des volumes élevés de réactifs tels que les dimères de CD1d aGalCer-chargés, et de longs temps de culture font certains protocoles publiés moins éthiquement et économiquement attrayante 9,13.
Dans ce rapport, nous décrivons une méthode adaptée pour l'isolement et dans l'expansion in vitro de cellules iNKT de rate de souris. Plus précisément, le protocole décrit un procédépour enrichir les cellules iNKT de rate de souris qui réduit les souris, les réactifs et le temps requis pour FACS tri cellulaire, et propose une approche optimisé pour l'expansion des cellules iNKT spléniques triées in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques dans le protocole actuel comprennent l'isolement et l'enrichissement ultérieur de CD5 + lymphocytes (Section 1 & 2), tri FACS (section 3) et l'étalement initial de cellules iNKT (section 4). Parmi les étapes effectuées dans la section 1, rappelez-vous à la couche attentivement la suspension cellulaire splénique sur le milieu de gradient de densité telle que une interphase cellulaire distincte est générée après la centrifugation. L'enrichissement ultérieur …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
Riferimenti
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