셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

이 프로토콜은 11 월 24 일의 유럽 공동체위원회 지침을 준수하여 설계되어, 1986 년 (6백9분의 86 / EEC) 및 우리의 동물 복지 제도위원회 (CETEA-CEA DSV IDF)에 의해 승인되었습니다. 문화 Videomicroscopy 1. 기본 설정 이전 공 초점 영상 현미경 유리 바닥 배양 플레이트 또는 μ-플레이트를 사용합니다. 1 – / 웰 5 × 103 세포 / 웰 이상 5 × 10 3 세포를 96 웰 플레이트 24 웰 플레이트를 사용합니다. 적어도 일일 전에 실험을 시작으로, 부착 단층 문화에 대한 멸균 폴리 -D- 라이신 (PDL) 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 각 웰 코트의 바닥에 충분히 PDL (dH2O 중에서 10 ㎍ / ml)에 첨가하고 37 ℃에서 O / N을 부화. PDL 용액을 제거하고 플레이트 층류 아래에 적어도 2 시간 동안 건조 후드 허용하기 전에 DH 2 O로 3 회 헹군다. 즉시 사용하지 않는 경우에 코팅 된 플레이트를 저장할-20 ° C. 9에서 NSC 기초 배지 및 NSC 확산 보충을 혼합하여 배지를 준비 : 1의 비율로 2 μg의 / ㎖ 헤파린, 20 NG / ㎖의 정제 된 인간의 재조합 표피 성장 인자 (EGF), 10 NG / ㎖와 함께 (재료 표 참조) 재조합 인간 섬유 모세포 성장 인자 2 (FGF-2). 사용 전에 수조에서 37 ℃로 배양 배지를 워밍업. SVZ 해리를 들어, 파파인 용액을 제조 하였다 : 1 ㎎ / ㎖ 파파인 0.2 ㎎ / ㎖의 L 시스테인, 0.2 ㎎ / ㎖ EDTA, 및 0.01 ㎎ / ㎖의 DNase I을 함유하는 얼 밸런스 염 용액 (EBSS)에서 (15 UI / mL) 중 PBS에서. 0.2 ㎛의 필터를 통과하여 용액을 소독. 사용 전에 37 ℃에서 용액을 평형화. DMEM : F12 배지 0.7 ㎎ / ㎖의 트립신 억제제를 함유하는 II 형 효소 반응을 중지하기 위해, 프로테아제 저해제 용액 (Ovomucoid)을 준비한다. 0.2 μm의 필터를 사용하여 용액을 필터. 뇌와 PBS 0.15 % BSA의를 수집하기 위해 포도당 솔루션 PBS 0.6 % 준비세척 단계에 대한 항체 염색법에 대한 olution. 해부하고, 메스를 집게를 묶는, 가위 : 해부 도구를 준비합니다. 70 % 에탄올에서 그들을 적시. 2. 수확 성인 마우스의 뇌와 SVZ Microdissections 해당 기관의 지침에 따라 자궁 경부 전위를 수행 희생 성인 FUCCI 마우스 (23) (2 ~ 3 개월 및 / 또는 연구를 노화에 대한 12 개월). 70 % 에탄올을 사용하여 마우스 스프레이 날카로운 가위를 사용하여 머리를 잘라. 두개골을 나타 내기 위해 두피를 따라 절개를합니다. 위의 작은 쌍을 사용 후각 전구 향해 두개골의베이스에서 시작 세로 중심선 절단을 수행한다. 가위 블레이드 기본 뇌 손상을 방지해야합니다. 뇌를 노출 곡선 집게와 두개골의 상단 개방 부분을 제거합니다. PBS에 0.​​6 %의 포도당을 포함하는 15mm 페트리 접시에 뇌를 수집합니다. 디후각 전구를 멀리 issect. 는 등의 표면에 뇌를 놓고 메스를 사용하여 광학 chiasm 통해 코로나 섹션을 확인합니다. 해부 현미경, 실험자 향해 위쪽으로 향하도록 관상 잘라 뇌 표면 부의 일부를 배치 입쪽. , SVZ을 해부 벌금 곡선 집게로 격막을 제거하려면 다음 뇌실 바로 옆에 줄무늬로 미세 집게 중 하나 팁을 삽입하고 주변 조직에서 SVZ를 분리합니다. 자세한 내용은 Azari 등. (24)을 참조하십시오. PBS-0.6 % 포도당 1 ㎖를 포함하는 배양 접시에 해부 SVZ를 놓습니다. 3. SVZ 조직 해리 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 배양 접시에 해부 SVZ를 말하다. 5 분 동안 200 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 PBS-0.6 %의 포도당과 함께 다진 조직을 전송합니다. (1 뜨는을 취소하고 미리 예열 파파인 1 ㎖를 추가㎎ / ㎖, 37 ℃ 수조에서 10 분 동안 0.01 ㎎ / ㎖ DNase를 I. 인큐베이션 보충) 단계에서 제조 된 1.4. 마우스 당 파파인 1 ㎖를 사용합니다. 5 분 200 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 1 ML을 추가 ovomucoid 미리​​ 예열 (0.7 ㎎ / ㎖, 단계 1.5에서 준비) 파파인 활동을 중지 할 수 있습니다. 기계적으로 부드럽게 P1000의 마이크로 피펫 팁을 통해 아래로 20 회를 피펫 팅에 의해 단일 ​​세포 현탁액에 추가 다진 조직을 떼어 놓다. 공기 방울을 피하십시오. 15 mL의 새 튜브에 20 ㎛의 멸균 필터를 통해 세포 현탁액을 통과한다. 세포 손실을 방지하기 위해 PBS 0.15 %의 BSA와 세포 필터를 세척해야합니다. 10 분 동안 200 XG에서 원심 분리기와 상층 액을 버린다. 0.15 %의 BSA를 함유하는 PBS 100 ㎕에 세포를 다시하는 것은 일시 중지. 셀 정렬 4. 면역 형광 염색법 셀 FUCCI – 레드 마우스 (그림 2A)는, 다음을 사용하여 정렬항체 : CD24 피코 에리 트린 – cyanine7 접합체 [PC7] CD15 / 렉스 형광 염료 [FITC] 결합 및 Ax647 복합 EGF 리간드. 참고 : 렉스 + EGFR + 세포와 EGFR + 세포는 성인 SVZ 풍부하지 않은 : ≈ 600 1500 세포 / 마우스 각각 9. 우리는 충분한 자료를 가지고 2 ~ 3 마우스에서 SVZ 세포를 풀링하는 것이 좋습니다. 셀 정렬 지속 기간을 3 시간을 초과하지 않도록 동일한 날에 12 개 이상의 마우스 작동하지 않는다. 같은 날에 너무 많은 마우스로 작업하는 증가 된 세포 정렬 지속 가능성이 증가 세포 사멸 및 / 또는 세포 분화의 결과로 이어질 것이라는 점을 명심하십시오. 마우스 (혹은 최적의 염색에 대한 2 마우스 3의 그룹에 대한 200 μL)에 PBS 0.15 %의 BSA 100 ㎕의 FACS 염색을 수행합니다. 제어 튜브를 준비합니다. 제조 업체에 따라 단일 색상 제어 튜브를 준비하는 보상 구슬을 사용하여9;의 프로토콜입니다. 세포의 일부 (한 마우스 충분하다로부터 추출 된 세포의 1/10)을 선택하고 1 음성 대조군 튜브 (표시되지 않은 세포)와 3 형광을 뺀 (FMO) 제어 튜브를 준비하는 4 튜브를 분리합니다. 튜브 당 PBS, 0.15 %의 BSA 200 μL에 세포를 재현 탁. 힌트 : LEX-FITC FMO 제어를 위해, CD24-PC7 (1:50)과 Ax647 – 복합 EGF 리간드로 세포 (1 : 200) 레이블; 및 Ax647 – 복합 EGF 리간드 FMO 제어를위한 CD15 / LeX-와 세포를 라벨 : CD24-PC7 FMO 제어, CD15 / LEX-FITC (1시 50분) 및 Ax647 – 복합 EGF 리간드 (200 1)와 셀 라벨 FITC (1시 50분) 및 CD24-PC7 (1시 50분). 셀 정렬을 위해 사용되는 튜브를 들어, PBS에 표시된 희석에서 0.15 %의 BSA를 다음과 같은 항체를 사용 CD24-PC7 (1시 50분), CD15 / LEX-FITC (1시 50분) 및 Ax647 – 복합 EGF 리간드 (1 : 200). 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어. 10 분 동안 200 XG에 1 ml의 PBS 0.15 %의 BSA와 원심 분리기로 세척. (200)에서 세포를 재현 탁81; 뇌 당 PBS 0.15 %의 BSA의 L. 얼음에 셀 정렬 튜브를 유지하고 세포 정렬을 바로 진행합니다. FUCCI – 녹색 마우스를 사용하는 경우, 셀이 LEX-FITC 항체 공유로 FUCCI 녹색 형광보다 같은 발광 파장 정렬하기 전에 분리 컬럼을 사용하여 별도의 렉스 양성과 렉스 음성 분수 (그림 3A를, B). 먼저, PBS, 0.15 %의 BSA 100 ㎕에서 어두운 4 ° C에서 15 분간 마우스 항 – 인간 항체 렉스 (1시 50분)와 셀 라벨. 다음 어둠 속에서 4 ° C에서 15 분 동안 항 – 마우스 IgM의 마이크로 비드 (1시 10분)와 셀 라벨, 10 분 동안 200 XG에 1 ml의 PBS 0.15 %의 BSA와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 10 분 동안 200 XG에 1 ml의 PBS 0.15 %의 BSA와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 500 μL PBS 0.15 %의 BSA의 세포를 재현 탁하고 그림 3 (C)에 도식화로 자기장 분리 컬럼을 통해 세포를 붓는다. 1 ml의 PBS 0.15 % B를 사용하여 열을 씻으십시오SA 렉스 부정적인 부분을 얻었다. 렉스 양성 분획을 얻기 위해, 자기장으로부터 분리 컬럼을 제거하고 PBS 2 ml의 0.15 %의 BSA와 함께 세포를 용출. 4.2에 표시된대로 CD24-PC7 및 Ax647 – 복합 EGF 리간드 염색을 진행합니다. 5. 셀 정렬 참고 : 세포는 86 μm의 noozle 40 psi에서 FACS 분류기에 분류되었다. 520 / 35nm를 (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20 나노 (Ax647) 및 740LP (PC7) : 형광 다음과 같은 필터 세트를 사용하여 수집 하였다. 오버랩 FUCCI 적색 형광의 발광 스펙트럼과 PC7 염료 사이에서 발견 될 때 보상은 위양성 신호를 방지 할 필요가있다. 정렬 세포 직전에, 죽은 세포에서 라이브를 구별 할 수있는 중요한 염료를 추가 할 수 있습니다. 우리는 2 μg의 / ml의 최종 농도 호를 (재료의 표 참조)를 사용. FACS 분류기를 선택 번째를 통해 음성 대조군 튜브 (표시되지 않은 세포)를 실행측면 산란 (SSC) 앞으로 분산 형 (FSC) 매개 변수 (그림 1A)를 사용하여 전자 세포. 주 : 사균은 (도 1a ') 만 HO 음성 분획을 게이팅하고 이중선이 네거티브 펄스 폭 분획 (도 1a를 선택에서 제외 된' ')에서 제외 하였다. 4.2 단계에서 제조 된 단일 색상 컨트롤을 실행하고 광전자 증 배관을 조정 (PMT)는 필요한 경우 (즉, 음의 인구가 너무 높은 및 / 또는 양성 세포 오프 규모) 전압. 소프트웨어 보상 창에 색 보정을 수행한다. 실행 FMO 단계 4.2 (LEX-FITC FMO 제어, CD24-PC7 FMO 제어 및 Ax647 – 복합 EGF 리간드 FMO 제어)에서 준비를 제어하고 정렬 게이트 (그림 1)을 그립니다. 직접 1.5 ML의 마이크로 튜브에서 배양 배지 100 ㎕로 정렬 세포. 현미경에 대한 세포의 6. 준비 갓 분류 셀 플레이트1의 농도에서 S – 3 × 103 세포 / 웰의 폴리 옥시 -D- 라이신은 배양 배지 300 μl를 96 웰 플레이트 μ 코팅. 비디오 현미경에 앞서, 세포 부착을 허용하도록 적어도 1 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 배양 플레이트를 배양하고 5 %. 7. 현미경 설정 및 이미지 수집 CO 2 5 %의 분위기하에 37 ℃에서 반전 된 온도 조절 챔버에 부착 된 공 초점 레이저 주사 현미경 시스템에서 : 플랜 아포 VC 20 배의 대물 DIC (0.75 NA)를 사용하여 라이브 영상을 수행한다. 예열 및 평형 온도 조절 챔버 내부 96 – 웰 μ-플레이트를 놓고 항온 커버로 뚜껑을 교체합니다. NIS 요소 소프트웨어를 열고에 메뉴 표시 줄을 클릭 시간 경과의 옵션 (길이, 무대 위치, 공 초점 Z 섹션, …), "취득 / 취득 컨트롤을 선택"취득 / 취득 / ND 획득을 제어 " / 티 패드(221); 목표를 선택하고 "취득 / 취득 컨트롤 / A1plus 설정"메뉴 바의 각 형광의 PMT 레벨을 선택합니다. 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. ND 획득 창을 사용하여, 각각의 중심뿐만 아니라 스테이지 위치를 설정하고 7 × 7 mm² 인에 큰 이미지 옵션을 선택한다. 이 각 웰의 중심을 모자이크 이미지를 만듭니다. 5 %로 큰 모자이크 이미지의 중첩을 설정합니다. 24 시간 동안 매 20 분 사진을 촬영합니다. 티 패드 창에서 : 계획 아포 VC 20 배 DIC 목표 (0.75 NA)를 선택합니다. A1plus 설정 창에서, 1.26 μm의 / 픽셀의 해상도 512 X 512 픽셀 형식에서 고속 공진 스캐너를 사용하여 이미지를 획득. 세포 모양을 시각화하는 시야를 사용합니다. FUCCI – 레드 마우스의 경우, 561 nm의 적색 형광을 여기하고 50분의 595 nm 인 필터를 이용하여 수집한다. FUCCI 그린 쥐의 경우에, 488 nm에서 녹색 형광을 여기하고 40분의 530 nm 인 필터를 이용하여 수집한다. 최적의 오후를 결정각 파장에 대한 T 수준, 오프셋 및 레이저 파워. 참고 : 우리는 소프트웨어가 각 획득하기 전에 각 단계의 위치에 오토 포커스 기능 할 수 있도록 시야 채널의 오토 포커스 기능을 사용하는 것이 좋습니다. 힌트 : 계획 아포 VC 20 배 DIC 목표 (NA : 0.75)는 기름 없이도 뛰어난 해상도를 사용 하였다. 다른 목적은 목적하는 광학 해상도에 따라 사용될 수있다. 수집을 시작하기 위해 ND 획득 창에서 '지금 실행'버튼을 선택합니다. 힌트 : 제대로 작동에서 그 모든 것을 확인하기 위해 1 루프 컴퓨터 작업을 수행합니다. 8. 이미지 처리 및 분석 개별 세포를 추적함으로써 NIS 요소 소프트웨어에 직접 데이터를 분석한다. 힌트 : 시간을 얻을 NIS 요소 소프트웨어를 사용하여 .AVI 형식으로 각각의 위치를​​ 저장하고 ImageJ에 함께 영화를 분석합니다. ImageJ에 소프트웨어에서 적어도 2 부문 (즉, 하나의 셀을 겪고 개별 셀을 추적4 셀 식민지). 셀 주위에 작은 영역을 자르기와 '이미지 / 중복'을 선택합니다. 몽타주를 만들기 위해 메뉴 바에서 '이미지 / 스택 / 확인 몽타주'를 선택합니다. , 프레임이 포함되는 이미지의 크기를 지정하고 최적의 해상도 된 .tif 파일로 몽타주를 저장합니다. 첫 번째 SG 2 / M 상 길이 (그림 2C, D)를 계산하려면, (G 1) 단일 빨간 형광 셀을 선택한 다음 t는 (붉은 형광이 꺼 일단 시작 S 상) = 0으로 설정합니다. 셀 2 SG / M의 길이를 추정 할 때까지 분할 프레임들의 개수를 카운트. 주 : 계산 된 시간은 각각의 프레임 간의 시간 간격에 따라 달라진다. 다음 단계 G1 (도 2C, D)를 계산하기 위해, 단지 분할 셀을 추적하는 것을 계속한다. 분할 세포가 G1 단계를 입력하면, cdt1 붉은 형광 단백질의 축적이있을 것이다. 붉은 형광이 AGA를 전환 할 때까지 프레임의 수를 계산각 셀에. 힌트 : G (1)의 시작 부분에서 붉은 형광이 약한 될 수 있도록 셀이 근사치를 방지하기 위해 분할 한 프레임에 G 1 단계의 시작을 선택합니다.