Quantification des souches du côlon mutations de cellules

Le cancer du côlon est pensé pour impliquer une exposition à des agents environnementaux et composants alimentaires qui peuvent endommager l'ADN et de produire des mutations activatrices somatiques dans oncogènes (par exemple, la ß-caténine) ou d'inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple, APC). On suppose que ces mutations se produisent dans les cellules critiques souches du côlon. En raison de l'architecture de la crypte unique de l'épithélium du côlon, il est possible de mesurer des mutations de cellules souches dans le côlon après avoir exposé les animaux à des produits chimiques associés à la cancérogenèse colique. Plusieurs enzymes liées au chromosome X peuvent servir d'indicateurs pour des mutations qui se produisent dans les cellules souches, comme les mutations seront présentes dans toutes les cellules au sein d'une crypte.

Auparavant, une procédure a été publiée démontrer que les produits chimiques qui induisent des tumeurs du côlon chez les souris générées également des mutations de cellules souches somatiques dans le côlon par l'intermédiaire d'une analyse de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase liée à l'X (G6PD) gène ^1-3.La méthode quantifie l'incidence des mutations somatiques aléatoires dans les cellules souches du côlon sans aucune pression de sélection. La procédure implique la production de sections congelées non fixées du côlon de souris traitées et de contrôle et l'identification des cryptes dépourvues de cellules qui produisent l'activité de la G6PD fonctionnel. Ces cryptes mutées, qui apparaissent blancs, indiquent que la mutation a eu lieu dans une cellule souche qui a donné lieu à une progéniture hébergeant également gène G6PD mutant. Dans le dosage enzymatique, G6PD mutant déficient cryptes peuvent pas oxyder le glucose-6-phosphate, qui est nécessaire pour la réduction du nitro bleu de tétrazolium (NBT). Lorsque l'enzyme est fonctionnelle en G6PD, le NBT dans le mélange de coloration est réduite à formazan insoluble et précipités, l'accumulation à l'emplacement de l'enzyme et des cellules "bleues" de coloration. Les cellules qui sont des mutants de la G6PD restent blanchâtre à la différence de cryptes colorés bleus de type sauvage. Cette méthode permet de mesurer les mutations qui ont un phénotype «nulle». Parce que enenzymes, comme la G6PD, peut diffuser hors des cellules sur une section de tissu non fixé si les articles sont placés dans une solution aqueuse, il est nécessaire de stabiliser l'enzyme dans les sections de tissu à analyser. ⁴ La stabilisation de l'enzyme dans le le tissu ne doit pas interférer avec la diffusion de petites molécules nécessaires à la réaction enzymatique en G6PD de réactifs.

Nous avons fait un certain nombre de changements importants dans la procédure initiale. Le milieu pour la coloration enzymatique critique a été modifié à partir de l'alcool polyvinylique à Optimal Cutting Température composé (OCT), ce qui facilite le contrôle du pH et la solubilisation des composants utilisés dans l'essai. La coloration est effectuée en utilisant 0,4 – 0,5 ml puits en rondelles en acier de sorte que chaque section de tissu a reçu le même volume de mélange de réaction de la G6PD. Une procédure a été développée pour estimer le nombre de cryptes dans une section imagée qui fournit un grand échantillonnage du tissu du côlon, sans avoirde compter manuellement> 10 ⁵ cryptes pour chaque colon. L'analyse des coupes de tissus adjacents 7 um permet la visualisation d'une crypte mutant sur plus d'un coulisseau, ce qui permet de réduire des artefacts de coloration potentiels. Ces changements rendent la procédure plus efficace et reproductible.

En utilisant ce protocole révisé, nous avons quantifié la fréquence de mutation dans les cellules souches du côlon après exposition des souris C57BL / 6 à azoxyméthane, un cancérogène du côlon bien connu chez les rongeurs. ^5-7