Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem em células estaminais, como as mutações vão estar presentes em todas as células dentro de um cripta.

Anteriormente, foi publicado um procedimento demonstrando que os produtos químicos que induzem tumores do cólon em ratos também gerado mutações somáticas de células estaminais no cólon através de análise de mutações em glicose-6-fosfato desidrogenase ligada ao cromossoma X do gene (G6PD) ^1-3.O método quantifica a incidência de mutações somáticas aleatórios em células estaminais do cólon sem qualquer pressão selectiva. O procedimento envolve a produção de secções de cólon congelados não corrigidos de camundongos tratados e de controlo ea identificação das criptas desprovidas de células que produzem atividade G6PD funcional. Estes criptas mutadas, que aparecem branco, indicam que a mutação ocorreu em uma célula estaminal que deu origem a progénie também albergar um gene G6PD mutado. No ensaio enzimático, G6PD criptas mutante deficiente não pode oxidar a glicose-6-fosfato, o qual é necessário para a redução de nitro azul de tetrazólio (NBT). Quando a enzima é funcional em G6PD, o NBT na mistura corante é reduzida a formazano insolúvel e precipitados, acumulando no local da enzima e células "azuis" de coloração. As células que são mutantes G6PD permanecem esbranquiçada em contraste com corados com Azul criptas do tipo selvagem. Este método mede a mutações que têm um fenótipo "nulo". Porque enZymes, tais como G6PD, pode difundir para fora das células sobre uma secção de tecido não fixado se as secções são colocadas numa solução aquosa, que é necessário para estabilizar a enzima nas secções de tecido a serem analisadas. ⁴ A estabilização da enzima na tecido não deve interferir com a difusão de moléculas pequenas de reagentes necessários para a reacção enzimática de G6PD.

Fizemos uma série de mudanças significativas para o processo inicial. O meio para a coloração enzimática crítico foi alterado de álcool polivinílico óptima para o Composto Temperatura de corte (OCT), o que facilita o controlo do pH e a solubilização dos componentes utilizados no ensaio. A coloração é realizada usando 0,4 – 0,5 ml poços feitas de anilhas de aço de modo a que cada secção de tecido recebeu o mesmo volume da mistura de reacção de G6PD. Um procedimento foi desenvolvido para estimar o número de criptas em uma secção trabalhada que fornece uma grande amostragem de tecido do cólon sem terpara contar manualmente> 10 ⁵ para cada criptas do cólon. A análise de 7 uM secções de tecido adjacentes proporciona a visualização de uma cripta mutante em mais de uma corrediça, o que reduz os potenciais artefactos de coloração. Estas alterações tornam o procedimento mais eficiente e reprodutível.

Usando este protocolo revisto, temos quantificada a frequência de mutação em células estaminais do cólon após a exposição de ratinhos C57BL / 6 para azoximetano, um carcinogéneo cólon bem conhecido em roedores. ^5-7