Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

La retina è parte del sistema nervoso centrale ed è, con la sua relativa semplicità e architettura cellulare ben caratterizzato, un modello popolare per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. L'occhio dell'embrione di pollo è relativamente grande rispetto al resto dell'embrione. E 'quindi facilmente accessibile di ovo per manipolazioni sperimentali, come le iniezioni o elettroporazione, e serve come un ottimo strumento per acquisire conoscenze su cellule della retina e biologia dello sviluppo in vivo. Nonostante questi importanti vantaggi, la sopravvivenza degli embrioni può essere basso quando gli esperimenti sono invasivi come ad esempio con electroporations, iniezioni ripetute o manipolazioni sperimentali combinati.

Elettroporazione di plasmidi DNA nell'embrione di pollo in ovo è una importante e consolidata tecnica ^1. Esso consente per l'etichettatura dei neuroni, tracciando del destino delle cellule, così come tratti neuronali nella NERV centroSistema di unità organizzative e permette per l'espressione genica ectopica di analizzare la funzione delle proteine ​​in vivo. La tecnica è stata utilizzata per gli studi di tubo neurale ^2, romboencefalo ^{3, 4} e della retina. Elettroporazione di retina embrionale in ovo ha qualche difficoltà sperimentali che sono legati alla situazione in vivo. La posizione dell'occhio, a causa della piegatura craniale dell'embrione, è relativamente vicino al cuore. Questa vicinanza aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l'elettroporazione, e il rischio aumenta con l'età dell'embrione. Inoltre, per accedere l'occhio, è necessario aprire le membrane embrionali, aumentando così il rischio di sanguinamento, malformazioni e conseguente ridotta vitalità. Durante il test e l'ottimizzazione di un nuovo plasmide DNA spesso senza un risultato fenotipico noto, queste limitazioni possono diminuire l'efficacia e la potenza del metodo anche per un sperimentalista con esperienza. Come presentato in questo protocollo, la cultura del wespianto foro retina, definito come l'insieme retina neurale con dell'epitelio pigmentato rimosso, è un metodo efficace che completa l'approccio in ovo.

Iniezioni intraoculari di reagenti chimici sono relativamente facili da eseguire in ovo. Tuttavia, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti iniettati all'interno della retina neurale può essere difficile controllare completamente. Il volume iniettato può variare a causa delle perdite e il luogo esatto di iniezione può influenzare sia la distribuzione del reagente all'interno dell'occhio e la diffusione attraverso il corpo vitreo. La variabilità avrà importanti implicazioni per l'interpretazione dei risultati, quando cioè una curva dose-risposta per un inibitore viene definito sulla; in particolare se l'effetto è piccola e la finestra temporale dell'effetto è stretta. Inoltre, solo un occhio può essere utilizzato da ogni embrione durante l'esecuzione in esperimenti ovo a causa di potenziali effetti sistemici attraverso il flusso sanguignosul occhio controlaterale. Età matching è importante quando si studia lo sviluppo e la variabilità individuale tra trattati e degli embrioni di controllo possono portare a ulteriore variabilità sperimentale.

Per queste ragioni, un ex ovo metodo basato su espianti retinici da embrioni di pollo è stato sviluppato, in cui la retina neurale può essere esposto ad una uniforme e controllato condizione sperimentale in vitro. Il presente protocollo è stato sviluppato sulla base di precedenti protocolli ^5-9. Espianti di retina di fase (st) 20 (giorni embrionali [E] 3) a ST31 (E7) embrioni di pollo sono stati sezionati, colto e elettroporate con una concentrazione di DNA plasmidico definita o esposti ad un terreno contenente una concentrazione definita di un reagente chimico. Il protocollo presentato qui è stato implementato con successo in pubblicazioni recenti, utilizzando diversi reagenti chimici diversi, tra cui le autorità di regolamentazione della via danno al DNA, come KU55933, SB 218.078, e NSC 109555 Ditosylate, e il ciclo cellulare, come Cdk1 / 2 inibitore III ^10,11.