تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ
Summary
In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
Abstract
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Introduction
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد آخذة في الظهور بوصفه أداة قوية لدراسة 2،29 الأمراض العصبية والعضلية. حتى الآن، تم استخدام نظام الزرد للتحقق من صحة العضلات جديدة المسببة للأمراض الطفرات 16،17،30، توضيح pathomechanisms رواية 18، وتحديد العقاقير العلاجية جديدة محتملة 12،24. وقد أنشأت هذه الجهود الجماعية للفائدة الزرد لنموذج الأمراض العصبية والعضلية الإنسان. ومع ذلك، على الرغم من التقدم المحرز مع نماذج الزرد والثدييات، وهناك خيارات العلاج محدودة للمرضى داخل مجموعة واسعة من الحالات العصبية والعضلية. وبالتالي، وجود ارتفاع الطلب على تطوير علاج لهذه المجموعة من الأمراض المدمرة. في موازاة هذا الطلب على العلاجات غير يقابل ذلك من ضرورة الابتكار التجريبي المستمر، فضلا عن تحليل دقيق للتحقق من نماذج حيوانية جديدة واستراتيجيات علاجية المفترضة.
ويستخدم تحليل EBD عادة في نماذج الماوس لالأنسجة الدراسة وتلف الخلايا في الدماغ والقلب والعضلات والهيكل العظمي 27،31. وأبرزها، ويستخدم على نطاق واسع في EBD نماذج الماوس من مختلف الأنواع الفرعية ضمور العضلات لإظهار شدة العضلات عدم الاستقرار الغشاء وتلف 8. استخدام EBD للكشف عن الأضرار غشاء العضلات معلمة داعمة إنشاء التشابه بين النموذج الحيواني للدولة مرض الإنسان 9. قوة EBD في الماوس أدى عدة مختبرات، بما في ذلك منطقتنا، لتطوير وتطبيق EBD لنماذج الزرد من الأمراض العصبية والعضلية. نظرا لانطباق تحليل EBD، بنشاط يجري تنفيذها هذه التقنية لإثبات نماذج الزرد إلى حالة مرض الإنسان 11،15،22،24،32. واليرقات مع أغشية العضلات التالفة يكون EBD امتصاص وبالتالي مضان أحمر داخل الألياف العضلية. مضان لوحظ في الفضاء بين الألياف، ولكن ليس ضمن ألياف العضلات الفردية قد تكون أيضا مفيدة من الألياف فصل من الغشاء القاعدي في تيكان غياب الضرر الغشاء، وتوفير التفاصيل التشخيص مفيدة. تحليل EBD لديه إمكانية تطبيق ما بعد التحقق من صحة النموذج الحيواني. وقد أظهرت الجهود من مختبرنا مؤخرا أن تحليل EBD هو مفيد في التحقق من صحة الأدوية العلاجية قد تكون رواية 24. تحديد ما إذا كانت العلاجات المحتملة تقلل أو تلغي EBD امتصاص في نماذج الأمراض العصبية والعضلية يمكن أن تدل على العمل العلاجي المناسب 8. هذا النوع من التحليل يمكن أن تساعد في إنشاء آلية (ق) من العلاجات ويوسع تطبيق تحليل EBD.
كما هو الحال مع العديد من التقنيات، وتحليل EBD لديه العديد من المحاذير التي يجب مراعاتها أثناء التصميم والممارسة التجريبية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون تحديا لتحديد لجنة تنسيق المفردات نظرا لسماكة الأنسجة مع التقدم في السن. بالإضافة إلى ذلك، فمن السهل أن تتلف اليرقات في إعداد قبل وأثناء الحقن التامور، والحد من التهم التجريبية وزيادة الحاجة إلى الإعدادية أعداد كبيرة من اليرقات.وعلاوة على ذلك، يمكن أن الأضرار المادية التي لحقت اليرقات أثناء المناولة والحقن يؤدي إلى ايجابيات كاذبة عن العضلات التالفة يمكن أن يستغرق فترة تصل EBD. من أجل التغلب على بعض هذه العقبات، التي وصفناها استراتيجية الحقن المشترك في هذه المقالة الفيديو التي تسمح سهولة تحديد وموثوق بها اليرقات مع نجاح ضخ صبغة مباشرة بعد الحقن وقبل تحليل لاحقة. ضوابط شارك في حقن FITC-ديكستران لنجاح الحقن عن طريق السماح للتأكيد EBD في الأوعية الدموية قبل امتصاص عن طريق الألياف العضلية. هذا يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص حيث يصبح EBD مضان منتشر بشكل كبير في اليرقات بعد عدة ساعات إذا لم تجمع في الألياف العضلية. على هذا النحو، يمكن أن يكون من الصعب الكشف عنها. وبالإضافة إلى ذلك، في عداد المفقودين لجنة تنسيق المفردات وحقن EBD في صفار البيض أو تجويف الجسم يمكن، بعد الحضانة، يؤدي في مضان أحمر منتشر مماثل للسيطرة على الأجنة، ولكن مع احتمال انخفاض امتصاص الألياف العضلية التالفة. بشكل جماعي، هذه المغارةATS تشير حقن EBD يتطلب الصبر والممارسة من أجل تحقيق نتائج متسقة وموثوق بها.
في كل شيء، ونحن تصف طريقة عملية واضحة لإجراء تحليل EBD على يرقات الزرد. حتى الآن، واستخدام الزرد كنظام نموذج، خصوصا كنموذج الأمراض التي تصيب البشر، وقد يتوسع بسرعة. ومن المقرر جزئيا إلى استمرار تطوير وتعديل التقنيات التجريبية التي تعمل على تحسين بناء على المزايا الحالية للنظام الزرد هذا التوسع. توفر تقنية الحقن EBD أداة إضافية وقوية لترسانة الباحث للتحقق من صحة ودراسة نماذج أمراض العضلات الزرد. التنفيذ المستمر وتعديل هذه التقنية لديه القدرة التي تساعد في الكشف استراتيجيات علاجية جديدة وكذلك آليات المسببة للأمراض.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر ترينت وو للحصول على المساعدة الفنية له. علينا أيضا أن نعترف قسم طب الأطفال في مستشفى الأطفال المرضى وعلاج الخلقي ضمور العضلات (CMD) للحصول على التمويل السخي لهذا المشروع.
Materials
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
Riferimenti
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, . , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
- Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, . Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
