Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l'analisi metabolica in<em> Drosophila</em
Summary
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
L'obiettivo di questa procedura è quello di sviluppare le frazioni mitocondriali arricchito che producono sufficienti metaboliti mitocondriali per metabolomica studi che utilizzano Drosophila melanogaster. Nella nostra esperienza, la metabolomica analisi che utilizzano interi metodi di estrazione cellulari sono in grado di rilevare i cambiamenti sottili metaboliti mitocondriali di Drosophila. Tuttavia, frazionamento mitocondriale prima dell'analisi metabolomica aumenta la sensibilità per identificare spostamenti metaboliti mitocondriali.
I mitocondri sono organelli cellulari responsabili della fornitura del 90% dell'energia che le cellule hanno bisogno per la normale funzione 1. Negli ultimi anni è stato riconosciuto che i mitocondri hanno un ruolo molto più dinamico in funzione cellulare e organismal che soltanto la produzione di adenosina trifosfato (ATP), e sono ora riconosciuti come hub per la regolazione del metabolismo omeostasi 2,3. I mitocondri sono il risultato di un processo in cui endosimbiontica dislignaggi microbiche stinti fuse ~ 1,5 miliardi di anni fa 4. Come si sono evoluti in veri mitocondri organelli, i geni della endosimbionte sono stati incorporati nel genoma nucleare emergente. Negli animali oggi, circa 1.500 proteine mitocondriali sono codificate dal nucleo, mentre 37 geni rimangono nel mtDNA, 13 dei quali codificano proteine mitocondriali che sono subunità dei complessi enzimatici della fosforilazione ossidativa 5. Coordinamento tra mitocondri e compartimenti nucleari è necessaria per mantenere una corretta funzione mitocondriale.
Utilizzando i metodi descritti qui siamo stati in grado di rilevare i cambiamenti metabolici mitocondriali di Drosophila che derivano dalla manipolazione del coordinamento tra genomi mitocondriali e nucleari. Abbiamo utilizzato un ceppo di Drosophila in cui mtDNA dalle specie sorelle D. simulans è stato posto su un singolo D. melanogaster sfondo nucleare 6. Questo mitonuclear 'interrotto'il genotipo è stato confrontato con il 'nativo', o co-evoluti genotipo mitonuclear di D. melanogaster portando lo stesso genoma nucleare con la sua nativa D. melanogaster mtDNA. Il D. melanogaster e D. simulans mtDNA differiscono di ~ 100 amminoacidi e> 500 sostituzioni sinonime che influenzano mitonuclear 7,8 comunicazione. Abbiamo generato estratti mosca integrali e estratti arricchiti mitocondriali per studiare cambiamenti metabolici in risposta allo stress farmacologico. Qui mostriamo che quando si utilizza mitocondriali arricchito frazioni rileviamo cambiamenti pronunciati in metaboliti mitocondriali tra i nativi, genotipo co-evoluta portando la D. mtDNA melanogaster e il genotipo perturbato che trasportano D. simulans mtDNA. Al contrario, le modifiche dei metaboliti tra questi due genotipi sono sottili utilizzando normali metodi che utilizzano estratto intero volo. Pertanto, questo metodo ha fornito un percorso per capire come mtDNA mediare i cambiamenti mitocondriali inrisposta ai farmaci diversi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche di questo protocollo sono: 1) l'allevamento abbastanza mosche nello spazio abbondante. E 'molto importante non sovrappopolare gabbie demografia con più di 150 mosche ciascuna; 2) cambiare il cibo delle gabbie frequentemente per evitare la concorrenza cibo e stress nutrizionale; e 3) il mantenimento di tutti i campioni a 4 ° C per garantire l'integrità durante l'isolamento della frazione mitocondriale. Si raccomanda inoltre di raffreddare il buffer di isolamento, il tampone di lav…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
Riferimenti
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