Préparation de mitochondriales fractions enrichies pour métabolique Analyse en<em> Drosophila</em
Summary
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
Le but de cette procédure est de développer des fractions mitochondriales enrichis qui donnent suffisamment de métabolites mitochondriaux pour les études de métabolomique utilisant Drosophila melanogaster. Dans notre expérience, la métabolomique analyse en utilisant des méthodes d'extraction cellulaire entiers sont incapables de détecter les changements subtils de métabolites mitochondriaux chez la drosophile. Cependant, fractionnement mitochondrial avant l'analyse métabolomique augmente la sensibilité pour identifier les changements de métabolites mitochondriaux.
Les mitochondries sont des organelles cellulaires responsables de fournir 90% de l'énergie que les cellules ont besoin pour une fonction normale. Au cours des dernières années, il a été reconnu que les mitochondries jouent un rôle beaucoup plus dynamique dans la fonction cellulaire et organismique que de simplement produire de l'adénosine triphosphate (ATP), et sont maintenant reconnus comme des plaques tournantes pour la régulation de l'homéostasie métabolique 2,3. Les mitochondries sont le résultat d'un processus d'endosymbiose dans laquelle DISlignées microbiennes tinctes fusionné ~ il ya 1,5 milliards d'années 4. Comme les mitochondries ont évolué en véritables organites, les gènes de la endosymbiote ont été incorporés dans le génome nucléaire émergents. Chez les animaux aujourd'hui, environ 1500 protéines mitochondriales sont dotés d'codée tandis que 37 gènes restent dans la ADNmt, 13 qui codent pour des protéines mitochondriales qui sont des sous-unités des complexes enzymatiques de la phosphorylation oxydative 5. La coordination entre les mitochondries et les compartiments nucléaires est nécessaire pour maintenir la fonction mitochondriale appropriée.
En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons pu détecter des changements métaboliques mitochondriales chez la drosophile qui résultent de la manipulation de la coordination entre les génomes mitochondriaux et nucléaires. Nous avons utilisé une souche de Drosophila dans lequel l'ADNmt de son espèce sœur D. simulans a été placé sur un seul D. melanogaster fond nucléaire 6. Cette mitonuclear «perturbé»génotype a été comparé au génotype mitonuclear «natif», ou co-évolué de D. melanogaster portant le même génome nucléaire avec son D. natif melanogaster ADNmt. Le D. D. melanogaster et simulans ADNmt différer de ~ 100 acides aminés et> 500 substitutions synonymes qui affectent la communication mitonuclear 7,8. Nous avons généré des extraits de mouches entiers et des extraits enrichis mitochondrial pour étudier les changements de métabolites en réponse au stress pharmacologique. Ici, nous montrons que lorsque vous utilisez mitochondriales enrichi fractions nous détectons des changements marqués dans métabolites mitochondriaux entre le génotype de co-évolué natif portant le D. ADNmt melanogaster et le génotype perturbé transportant D. simulans ADNmt. En revanche, les modifications des métabolites entre ces deux génotypes sont subtiles en utilisant des procédés qui utilisent des normales à la mouche extrait entier. Par conséquent, cette méthode a fourni un trajet de comprendre comment ADNmt médiation modifications mitochondriales dansréponse à différents médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques de ce protocole sont les suivants: 1) l'élevage suffisamment vol dans l'espace en abondance. Il est très important de ne pas surpeupler les cages de la démographie de plus de 150 chaque vol; 2) modification de la nourriture des cages fréquemment pour éviter la concurrence alimentaire et le stress nutritionnel; et 3) le maintien de tous les échantillons à 4 ° C pour assurer l'intégrité lors de l'isolement de la fraction mitochondriale. Il est également recommandé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
Riferimenti
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