إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
الهدف من هذا الإجراء هو تطوير الكسور الميتوكوندريا المخصب التي تحقق ما يكفي من نواتج الأيض الميتوكوندريا لالايض الدراسات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في تجربتنا، والايض التحليل باستخدام أساليب الاستخراج الخلوية كلها غير قادرة على اكتشاف التغيرات الطفيفة الأيض الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، تجزئة الميتوكوندريا قبل التحليل الايض يزيد من حساسية لتحديد التحولات الأيض الميتوكوندريا.
الميتوكوندريا هي العضيات الخلوية مسؤولة عن توفير 90٪ من الطاقة التي الخلايا بحاجة لوظيفة عادية 1. في السنوات الأخيرة تم الاعتراف بأن الميتوكوندريا تلعب دورا أكثر نشاطا في وظيفة الخلوية والعضوي من مجرد إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ويتم الاعتراف الآن كمراكز لتنظيم التمثيل الغذائي التوازن 2،3. الميتوكوندريا هي نتيجة لعملية endosymbiotic التي ديساندمجت الأنساب الميكروبية صبغة ~ 1.5 مليار سنة مضت 4. كما الميتوكوندريا تطورت إلى العضيات الحقيقية، وأدرجت الجينات من معايش جواني في الجينوم النووي الناشئة. في الحيوانات اليوم، ما يقرب من 1500 بروتينات الميتوكوندريا هي المشفرة النووية، بينما لا تزال 37 الجينات في الحمض النووي المتقدري، 13 منها ترميز البروتينات الميتوكوندريا التي هي مفارز من المجمعات انزيم الفسفرة التأكسدية 5. هناك حاجة إلى التنسيق بين الميتوكوندريا ومقصورات النووية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا سليمة.
باستخدام الأساليب المذكورة هنا كنا قادرين على اكتشاف التغيرات الأيضية الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة التي تنتج عن التلاعب في التنسيق بين جينوم الميتوكوندريا والنووية. كنا سلالة من ذبابة الفاكهة التي و mtDNA من الأنواع الشقيقة D. وضعت simulans على D. واحد البطن خلفية النووية 6. هذا mitonuclear 'عطلت'ومقارنة التركيب الوراثي إلى التركيب الوراثي mitonuclear "الأصلي"، أو تطورت المشارك لD. البطن تحمل نفس الجينوم النووي مع D. شعبه الأصيل البطن و mtDNA. وD. البطن وD. simulans mtDNAs تختلف باختلاف ~ 100 الأحماض الأمينية و> 500 بدائل مرادفة التي تؤثر mitonuclear 7،8 الاتصالات. ولدت لنا مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات المخصب الميتوكوندريا لدراسة التحولات الأيض ردا على الإجهاد الدوائي. نحن هنا تظهر أنه عند استخدام الميتوكوندريا المخصب الكسور نكتشف التحولات وضوحا في الأيض الميتوكوندريا بين الأصلي،-تطورت شارك الوراثي تحمل D. mtDNAs البطن وراثى تعطلت تحمل D. simulans و mtDNA. في المقابل، فإن التغييرات الأيض بين هذه الأنماط الجينية هما خفية باستخدام أساليب العادية التي تستخدم كله استخراج الطاير. ولذلك، قدمت هذه الطريقة مسار لفهم كيفية mtDNAs توسط التغييرات في الميتوكوندريااستجابة إلى أدوية مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي: 1) تربية كافية الذباب في الفضاء وفيرة. من المهم جدا أن لا overpopulate الأقفاص الديموغرافيا مع أكثر من 150 الذباب لكل منهما؛ 2) تغيير الغذائي للأقفاص في كثير من الأحيان لتجنب المنافسة المواد الغذائية والنقص الغذائي. و3) الحفاظ على جمي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
Riferimenti
- Scheffler, I. E. . Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria–a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
