Analys av<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Typ III-sekretionssystem är specialiserade proteinexport maskiner som används av olika släkten av gramnegativa bakterier för att direkt leverera bakteriellt kodade effektorproteiner in i eukaryotiska målceller. Medan utsöndringen maskinen själv är mycket konserverad, har specialiserade uppsättningar effektorproteiner utvecklats mellan de olika bakteriearter för att manipulera cellulära signaleringsvägar och underlätta specifika bakteriella virulens strategier ^1. Vid Yersinia, upp till sju effektorproteiner, så kallade Yops (Yersinia yttre proteiner), translokeras på värdcellkontakt och agera tillsammans för att undergräva immuncellsvar såsom fagocytos och cytokinproduktion, det vill säga att tillåta extracellulära bakteriernas överlevnad ^2-4. Processen för translokation är hårt kontrollerad i olika skeden ^5. Det är klarlagt att det primära aktivering av T3SS triggas av sin kontakt med målet cell ^6. Emellertid är den exakta mekanismen för denna initiering ännu att klarlägga. I Yersinia en andra nivå av sk finjustering av translokation uppnås genom upp- eller nedreglera aktiviteten hos de cellulära Rho GTP-bindande proteiner RAC1 eller RhoA. Aktivering av RAC1 t.ex. genom invasindomän eller cytotoxiska nekrotiserande faktor Y (CNF-Y) leder till ökad translokation ^7-9, medan GAP (GTPas aktiverande protein) funktion translokeras YopE nedreglerar RAC1 aktivitet och därmed minskar translokation av en negativ feedback typ mekanism ^10,11.

Giltiga och exakta metoder är en förutsättning för att undersöka hur transloka regleras under Yersinia värdcellinteraktion. Många olika system har använts för detta ändamål, var och en med särskilda fördelar och nackdelar. Vissa metoder förlitar sig på lys av infekterade celler men inte bakterier av olika rengöringsmedel följt av Western blot-analys. The gemensamma nackdel med dessa metoder är att mindre men oundvikligt bakteriell lys förorenar potentiellt cellysatet med bakterie tillhörande effektorproteiner. Emellertid var behandlingen av celler med proteinas K för att bryta ned extracellulära effektorproteiner och efterföljande användning av digitonin för selektiv lys av eukaryota celler föreslagits för att minimera detta problem ^12. Det är viktigt att dessa analyser avgörande beroende av högkvalitativa anti-effektor-antikroppar, som oftast inte är kommersiellt tillgängliga. Försök att använda translationella fusioner av effektorproteiner och fluorescerande proteiner som GFP att övervaka sloka var inte framgångsrika förmodligen på grund av den klotformiga tertiärstrukturen för de fluorescerande proteinerna och oförmågan av utsöndringsapparaten att veckla dem innan utsöndring ^13. Men flera olika reporter taggar såsom cya (kalmodulinberoende adenylatcyklas) domänen av Bordetella pertussis toxin cyclolysin ¹⁴ eller Flashtag har framgångsrikt använts för att analysera translokation. I det förra analysen den enzymatiska aktiviteten hos CyA används för att förstärka signalen av det intracellulära fusionsproteinet, medan Flash tagg, en mycket kort tetracysteine ​​(4Cys) motiv tagg, möjliggör märkning med biarsenical färgämnet Flash utan att störa processen för utsöndring ^15.

Tillvägagångssättet tillämpas här rapporterades för första gången av Charpentier et al. Och är baserad på den intracellulära omvandlingen av Förster resonansenergiöverföring (FRET) färgämne CCF4 av translokerade effektor TEM-1 betalaktamas fusioner ¹⁶ (Figur 1A). CCF4 / AM är en cell-genomtränglig förening där en kumarin derivat (donator) och en fluorescein enhet (acceptor) är förbundna med en cefalosporin kärna. Vid passiv inträde i eukaryota cellen är den icke-fluorescerande förestrad CCF4 / AM förening behandlas av cellulära esteraser till den laddade och fluorescerande CCF4 och därigenom instängdinom cellen. Excitation av kumarin-delen vid 405 nm resulterar i FRET till fluorescein-del, som avger ett grönt fluorescenssignal vid 530 nm. Efter klyvning av cefalosporinet kärnan genom beta-laktamas FRET avbryts och excitation av kumarin-delen leder till blå fluorescensemission at460 nm. Olika tillämpningar av denna metod har beskrivits i litteraturen som markerar dess mångsidighet. Metoden möjliggör analys av translokation in vitro och även in vivo, till exempel, var den teknik som används i en infektion musmodell för att identifiera leukocytpopulationer riktade för translokation in vivo ^17-19. Avläsning av signalerna kan utföras med användning plattläsare, FACS-analys eller fluorescensmikroskopi. Notera, ger metoden också möjligheten att övervaka translokation i realtid genom live-cell mikroskopi under infektionsprocessen ^20,21. Här laserskanning fluorescensmikroskopi söktes readout av fluorescens signaler eftersom det ger högsta känslighet och noggrannhet. I synnerhet förmågan justera emissionsfönstret med nanometer precision i kombination med hög känsliga detektorer underlättar optimerad fluorescensdetektion och minimerad överhörning. Dessutom denna mikroskopi inställning kan anpassas för realtidsövervakning av sloka och potentiellt medger samtidig analys av värdpatogen interaktion på cellnivå.

I denna studie slokahastigheter en Y. enterocolitica vildtypstammen och YopE deletionsmutant uppvisar en hypertranslocator fenotyp ^10,11 var exemplariskt analyseras.