का विश्लेषण<em> यर्सीनिया enterocolitica</emमेजबान कोशिकाओं में> प्रेरक translocation बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक Fusions का उपयोग
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
रोगजनक यर्सीनिया एसपीपी सहित कई ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया। यूकेरियोटिक लक्ष्य कोशिकाओं में प्रेरक प्रोटीन सरकाना करने प्रकार III स्राव सिस्टम को रोजगार। मेजबान कोशिका के अंदर प्रेरक प्रोटीन बैक्टीरिया के लाभ के लिए सेलुलर कार्यों में हेरफेर। बेहतर translocation को मापने के लिए मेजबान सेल बातचीत, संवेदनशील और सटीक assays के दौरान प्रकार III स्राव के नियंत्रण को समझने के लिए आवश्यक हैं। हम यहाँ एक यर्सीनिया enterocolitica प्रेरक प्रोटीन टुकड़ा के विलय पर आधारित एक परख (यर्सीनिया बाहरी प्रोटीन; YopE) के आवेदन का वर्णन है। स्थानान्तरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ साथ परख के लिए एक सेल की दरार पर निर्भर करता है permeant झल्लाहट डाई translocated बीटा-लैक्टामेज़ संलयन द्वारा (CCF4 / बजे)। Fluorescein बाधित और कूमेरिन आधा भाग की उत्तेजना नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की ओर जाता है के लिए बीटा-लैक्टामेज़ द्वारा CCF4 के Cephalosporin कोर की दरार के बाद, कूमेरिन से झल्लाहट।इस विधि के विभिन्न अनुप्रयोगों अपनी बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला साहित्य में वर्णित किया गया है। विधि एक माउस मॉडल में, इन विट्रो में स्थानान्तरण के विश्लेषण के लिए और भी इन विवो, जैसे की अनुमति देता है। प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने प्लेट पाठकों, FACS विश्लेषण या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। अलग यर्सीनिया म्यूटेंट द्वारा हेला कोशिकाओं में प्रेरक Fusions की इन विट्रो translocation में, यहाँ वर्णित सेटअप में लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी है। वास्तविक समय में बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक संलयन द्वारा झल्लाहट रिपोर्टर के intracellular रूपांतरण रिकॉर्डिंग मजबूत मात्रात्मक परिणाम प्रदान करता है। हम यहाँ एक वाई की वृद्धि हुई translocation का प्रदर्शन, अनुकरणीय डेटा दिखाने जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में enterocolitica YopE उत्परिवर्ती।
Introduction
प्रकार III स्राव सिस्टम सीधे यूकेरियोटिक लक्ष्य कोशिकाओं में bacterially इनकोडिंग प्रेरक प्रोटीन देने के लिए ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के विभिन्न पीढ़ी द्वारा उपयोग विशेष प्रोटीन निर्यात मशीनें हैं। स्राव मशीनरी में ही अत्यधिक संरक्षित है, वहीं प्रेरक प्रोटीन का विशेष सेट सेलुलर संकेत दे रास्ते में हेरफेर और विशिष्ट बैक्टीरियल विषैलापन रणनीतियों 1 की सुविधा के लिए विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु के बीच विकसित किया है। यर्सीनिया के मामले में, सात प्रेरक प्रोटीन, तथाकथित Yops (यर्सीनिया बाहरी प्रोटीन) के लिए, मेजबान सेल संपर्क पर translocated और ऐसे यानी phagocytosis और साइटोकाइन उत्पादन, के रूप में प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया नाश करने के लिए एक साथ काम कर रहे हैं, बैक्टीरिया के बाह्य अस्तित्व की अनुमति के लिए 2-4। translocation की प्रक्रिया कसकर विभिन्न चरणों 5 पर नियंत्रित किया जाता है। यह T3SS के प्राथमिक सक्रियण लक्ष्य सीई को अपने संपर्क में आने से शुरू हो रहा है कि स्थापित हैकरूँगा 6। हालांकि, इस दीक्षा की सटीक व्यवस्था अभी तक स्पष्ट की जानी है। यर्सीनिया में स्थानान्तरण के तथाकथित ठीक ट्यूनिंग के एक दूसरे स्तर ऊपर से या नीचे विनियमन सेलुलर रो जीटीपी बंधनकारी प्रोटीन Rac1 या RhoA की गतिविधि हासिल की है। Invasin या साइटोटोक्सिक नेक्रोटाइज़िंग कारक वाई (CNF-वाई) द्वारा जैसे Rac1 के एक्टिवेशन गैप translocated YopE के समारोह (GTPase प्रोटीन सक्रिय) जबकि Rac1 गतिविधि नीचे-नियंत्रित करता है और तदनुसार एक नकारात्मक प्रतिक्रिया प्रकार से translocation कम हो जाती है, बढ़ translocation 7-9 की ओर जाता है तंत्र 10,11 की।
वैध और सटीक तरीके translocation यर्सीनिया मेजबान सेल बातचीत के दौरान नियंत्रित किया जाता है कैसे जांच करने के लिए शर्त है। कई अलग अलग प्रणालियों विशिष्ट लाभ और कमियों के साथ प्रत्येक, इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है। कुछ दृष्टिकोण पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद अलग डिटर्जेंट से संक्रमित कोशिकाओं की सेल नहीं बल्कि बैक्टीरिया पर भरोसा करते हैं। गुइन तरीकों में से ई आम दोष नाबालिग लेकिन अपरिहार्य बैक्टीरियल सेल संभावित बैक्टीरिया से जुड़े प्रेरक प्रोटीन के साथ सेल lysate contaminates है। हालांकि, बाह्य प्रेरक प्रोटीन और कोशिकाओं के चुनिंदा सेल के लिए digitonin के बाद के उपयोग नीचा करने के लिए proteinase कश्मीर के साथ कोशिकाओं के इलाज से इस समस्या को 12 कम करने के लिए प्रस्तावित किया गया। महत्वपूर्ण बात है, इन assays महत्वपूर्ण ज्यादातर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, जो उच्च गुणवत्ता विरोधी प्रेरक एंटीबॉडी, पर निर्भर करते हैं। प्रयास फ्लोरोसेंट प्रोटीन का गोलाकार तृतीयक संरचना और स्राव 13 से पहले उन्हें प्रकाशित करना स्राव तंत्र की अक्षमता को शायद सफल कारण नहीं थे translocation नजर रखने के लिए GFP जैसे प्रेरक प्रोटीन के translational fusions और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए। 14 या फ़्लैश cyclolysin Bordetella काली खांसी विष का हालांकि, CYA तरह कई अलग अलग संवाददाता टैग (calmodulin निर्भर adenylate साइक्लेज) डोमेनटैग सफलतापूर्वक translocation का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। फ़्लैश टैग, एक बहुत ही कम tetracysteine (4Cys) मूल भाव टैग, स्राव की प्रक्रिया के बिना परेशान biarsenical डाई फ्लैश के साथ लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि पूर्व परख में CYA के enzymatic गतिविधि इंट्रासेल्युलर संलयन प्रोटीन का संकेत बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है 15।
यहाँ लागू दृष्टिकोण से Charpentier एट अल। पहली बार के लिए सूचित किया गया था और translocated प्रेरक मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ fusions 16 (चित्रा 1 ए) द्वारा Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) डाई CCF4 के intracellular रूपांतरण पर आधारित है। CCF4 / पूर्वाह्न एक कूमेरिन के derivate (दाता) और एक fluorescein आधा भाग (स्वीकर्ता) एक cephalosporin कोर से जुड़े हुए हैं, जिसमें एक सेल permeant यौगिक है। यूकेरियोटिक सेल में निष्क्रिय प्रवेश करने पर, CCF4 / AM यौगिक एस्टरीकृत गैर फ्लोरोसेंट का आरोप लगाया और फ्लोरोसेंट CCF4 के लिए सेलुलर esterases द्वारा कार्रवाई की और इस तरह फंस गया हैकोशिका के भीतर। 530 एनएम पर एक हरे रंग की प्रतिदीप्ति संकेत उत्सर्जन करता है जो fluorescein आधा भाग, को झल्लाहट में 405 एनएम परिणामों पर कूमेरिन आधा भाग की उत्तेजना। बीटा-लैक्टामेज़ झल्लाहट द्वारा सेफैलोस्पोरिन कोर की दरार के बाद बाधित है और कूमेरिन आधा भाग की उत्तेजना एनएम at460 नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन होता है। इस विधि के विभिन्न अनुप्रयोगों अपनी बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला साहित्य में वर्णित किया गया है। विधि इन विट्रो में स्थानान्तरण के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और यह भी इन विवो, जैसे, तकनीक विवो 17-19 में translocation के लिए लक्षित ल्युकोसैट आबादी की पहचान करने के लिए एक माउस संक्रमण मॉडल में इस्तेमाल किया गया था। संकेतों के readout प्लेट पाठकों, FACS विश्लेषण या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। ध्यान से, विधि भी संक्रमण की प्रक्रिया 20,21 के दौरान रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा वास्तविक समय में translocation नजर रखने के लिए संभावना प्रदान करता है। यहां लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी readou के लिए लागू किया गया थाप्रतिदीप्ति संकेतों के टी यह उच्चतम संवेदनशीलता और सटीकता प्रदान करता है। विशेष रूप से, क्षमता उच्च संवेदनशील डिटेक्टरों के साथ संयोजन में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ उत्सर्जन खिड़की प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अनुकूलित और पार बात कम से कम की सुविधा को समायोजित करने के लिए। इसके अलावा इस माइक्रोस्कोपी सेटअप स्थानान्तरण के वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और संभवतः सेलुलर स्तर पर मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
एक वाई के इस अध्ययन translocation दरों में enterocolitica जंगली प्रकार के तनाव और एक hypertranslocator फेनोटाइप 10,11 का प्रदर्शन एक YopE विलोपन उत्परिवर्ती exemplarily विश्लेषण किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ सफलतापूर्वक वाई द्वारा प्रेरक स्थानान्तरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ संवाददाता आधारित परख लागू किया enterocolitica। इस संवेदनशील, विशिष्ट और अपेक्षाकृत सरल तकनी?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
Riferimenti
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