分析<em>小肠结肠炎耶尔森菌</em>效应易位到宿主细胞中使用β-内酰胺酶效应融合体

III型分泌系统，它们由不同的属的革兰氏阴性菌，直接递送细菌编码的效应蛋白到真核靶细胞利用专门蛋白出口的机器。而分泌机制本身是高度保守的，专门集效应蛋白进化的不同细菌种类中，以操纵细胞信号途径和促进特定细菌的毒力的策略^1。万一耶尔森氏菌，最多七个效应蛋白，所谓Yops（ 耶尔森氏菌外蛋白），被易位在宿主细胞接触并一起行动颠覆免疫细胞反应，如吞噬作用和细胞因子产生， 即，以允许细菌的胞外生存^2-4。易位的处理严格控制在不同阶段^5。它被确定，T3SS初级活化通过它的接触到目标策触发LL ^6。然而，这种引发的精确机制仍有待阐明。在耶尔森所谓微调易位的第二电平由上调或下调细胞的Rho GTP结合蛋白的Rac1或RhoA的活性实现的。 Rac1的激活例如通过侵袭素或细胞毒性坏死因子Y（CNF-Y）导致增加的易位^7-9，而GAP（GTP酶活化蛋白质）易位YopE的功能下调Rac1的活性，因此通过一个负反馈型降低易位机制^10,11。

有效和精确的方法是前提，以研究如何易位是在小肠结肠炎耶尔森氏宿主细胞相互作用调控。许多不同的系统已被用于这个目的，每个具有特定的优点和缺点。一些方法依赖于裂解感染的细胞，但不细菌由不同的去污剂随后免疫印迹分析。钍这些方法Ë共同的缺点是次要的，但不可避免的细菌裂解潜在污染的细胞裂解液与细菌相关的效应蛋白。然而，提出了治疗细胞用蛋白酶K以降解细胞外的效应蛋白和后续使用毛地黄皂苷为真核细胞的选择性裂解，以尽量减少此问题^12。重要的是，这些检测主要依赖于高品质抗效应的抗体，其中大多是尚未投放市场。企图利用效应蛋白翻译融合和荧光蛋白GFP的像并监控易位没有成功可能是由于该荧光蛋白的球状三级结构和分泌装置的无法分泌¹³之前展开它们。 百日咳毒素然而，有几个不同的记者的标签，如CYA（钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶）域cyclolysin ^14或闪存标签被成功用于分析易位。在前者的测定CYA的酶活性被用于扩增胞内融合蛋白的信号，而闪光标签，在很短的四半胱氨酸（4Cys）基序标签，允许与biarsenical染料的Flash标签，而不会干扰分泌的过程中^15。

这里所应用的方法是由夏邦杰等人报道首次并基于对细胞内的荧光共振能量转移（FRET）染料CCF4通过易位效应TEM-1β-内酰胺酶融合体^16（图1A）的转换。 CCF4 / AM是其中香豆素衍生物（供体）和荧光素部分（受体）由头孢菌素核连接的细胞穿透物化合物。在被动进入真核细胞，所述非荧光酯化CCF4 / AM化合物由蜂窝酯酶处理以带电和荧光CCF4从而被困内的小区。激发香豆素结构部分在405nm处的结果的FRET的荧光素部分，其在530nm发射的绿色荧光信号。头孢菌素核的β-内酰胺酶的FRET的裂解之后被破坏，香豆素结构部分的激励导致的蓝色荧光发射at460纳米。该方法的不同应用在文献中突出了其通用性已被描述。该方法允许易位体外的分析以及在体内，例如，该技术被用来在小鼠感染模型来识别体内 ^17-19针对易位的白细胞群。信号读出可使用酶标仪，流式细胞仪或荧光显微镜进行。值得注意的是，该方法还提供了感染过程^20,21期间监视易位实时由活细胞显微术的可能性。这里激光扫描荧光显微镜涂敷了用于readou荧光信号吨，因为它提供最高的灵敏度和精确度。特别是，能力调整与纳米精度与高敏感检测器组合的发射窗有助于优化荧光检测和最小化串扰。此外，该显微镜的设置可适于易位实时监测和有可能允许对宿主 – 病原体相互作用的在细胞水平上同时分析。

在这项研究中易位Y.率菌野生型菌株和YopE缺失突变体表现出hypertranslocator型^10,11示范性地进行了分析。