Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo

1. Sequência de design Nota: visão geral do design Sequência: Nesta seção, a estratégia para a criação de portas de DNA derivados de plasmídeo é descrito. Locais de enzimas colocados em cada extremidade das portas, para permitir a libertação de portas de cadeia totalmente dupla após a digestão. Nicking locais são então colocados de tal forma que as enzimas criar nicks na cadeia de cima para criar os portões finais ndsDNA. Finalmente, as restantes sequências são escolhidas de tal modo que os domínios independentes são ortogonais uma à outra e não exibem a estrutura secundária. Coloque o local nicking Nt.BstNBI quatro nucleótidos de distância a partir da extremidade 3 'de cada domínio de comprimento (a, b, c, r, e i). Coloque o local nicking Nb.BsrDI na extremidade 5 'de cada domínio longo (a, b, c e r. Note-se que o domínio I não tem qualquer local nicking Nb.BsrDI). A Figura 2C mostra a vista detalhada da sequência Junte-se AB e BC Fork portões. Coloque local de restrição PvuII em ambas as extremidades de portões ndsDNA de modo que a digestão com PvuII pode liberar as portas de plasmídeos (ver figura 2C). Conceber outras sequências não restringidas por dois princípios seguintes: (a) fios não deve apresentar estruturas secundárias (estruturas de ADN pode ser prevista utilizando NuPack 41), e (b) todos os domínios devem ser ortogonais para minimizar a diafonia. Coloque sequências ndsDNA no centro de um molde de portão. Coloque sequências espaçadoras 30-40 pb aleatórios em ambas as extremidades do molde portão, cada espaçador serve como um local de ligação único para a seguinte reacção em cadeia da polimerase (PCR). 2. Clonagem de NdsDNA portas em plasmídeos Nota: Esta seção descreve o método de clonagem Gibson para inserção de 4 cópias do portão em um backbone plasmídeo. Modelos de porta Pedido ndsDNA como blocos genómico de cadeia dupla a partir de um fabricante de ADN (sequências molde de porta são mostradosna Tabela 1; fios ocorrer em portões ndsDNA são mostrados na Tabela 2; sequências nível do domínio são mostrados na Tabela 3). Depois de receber o ADN ordenada, girar os tubos contendo blocos genómicos em 10,000-14,000 xg durante 1 min para garantir que todo o ADN é seco no fundo do tubo. Ressuspender as genómicas blocos secos em água isenta de ADNase para atingir uma concentração final de 10 ng / ul. Observação: Como alternativa, o DNA pode ser ressuspenso usando 1x Tris ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) tampão (tampão TE: Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 8,0). No entanto, o EDTA é um agente quelante para catiões bivalentes e pode inibir a PCR. Gerar 4 fragmentos de porta com diferentes regiões de sobreposição através de um PCR com um padrão de alta-fidelidade DNA polimerase (ver Figura 3A). As sequências dos iniciadores estão detalhados na Tabela 4 (temperatura de fusão destes iniciadores é de 62 ° C). Executar um gel de agarose a 2% a 140 V durante 30 min à temperatura ambiente (para um protocolo de electroforese em gel de agarose detalhada ver 42) e cortar as bandas correspondentes a cada fragmento de PCR amplificado para fora do gel. Em seguida, purificar as fatias de gel utilizando um kit de extracção de gel (por favor, referir-se aos Materiais) seguindo as instruções do fabricante. Digerir um número elevado de cópias de plasmídeo espinha dorsal (ver materiais) com PvuII e PstI-HF-HF a 37 ° C durante 1 h (ver Tabela 5) de acordo com o protocolo do fabricante. PvuII-HF e PstI-HF são enzimas de restrição de alta fidelidade, o que reduz drasticamente cortes inespecíficos. Executar um gel de agarose a 1,5% e cortar a espinha dorsal linearizado (tipicamente executar o gel a 140 V durante 30-40 min à temperatura ambiente). Em seguida, extrair o ADN a partir da fatia de gel utilizando o kit de extracção de gel de acordo com as instruções do fabricante. Realizar Gibson montagem 43 com o vector linearizado e fragmentos de PCR purificados (ver Tabela 6 e Figura 3B </strong>) a 50 ° C durante 1 h. Transformar o produto do passo de montagem Gibson 2,8 em Escherichia coli (E. coli) e em uma placa Lisogenia Broth (LB) contendo antibióticos placa de agar de ampicilina (a uma concentração de 100 ug / mL). Execute transformação através da eletroporação ou um método do choque térmico 44,45, e usar o apropriado E. estirpe de E. coli. Por exemplo, usar E. coli estirpe JM109 para a transformação de choque térmico, e usar DH5ct electrocompetentes E. células de E. coli para electroporação. Nota: A espinha dorsal do plasmídeo utilizado contém uma cassete de resistência à ampicilina. Se estiver usando um marcador de seleção diferente, usar os antibióticos apropriados em vez de ampicilina. 3. Cultura bacteriana Amplification e Controle de Qualidade Nota: Esta seção descreve a produção em massa e isolamento de plasmídeos contendo os portões de DNA após controle de qualidade. Escolha uma única colôniaa partir da placa de Ampicilina selectiva do passo 2.9 e incubar uma cultura de 3 ml de meio enriquecido contendo antibióticos ampicilina (a uma concentração de 100 ug / mL). Marque a colónia de tal modo que pode ser novamente utilizada nos passos subsequentes experimentais. Incubar a cultura a 37 ° CO / N com agitação vigorosa (200-300 rpm). Tipicamente, incubar durante 16-24 horas. Extrai-se a ADN de plasmídeo a partir da cultura bacteriana usando um kit Mini-prep seguindo as instruções do fabricante. Medir o DNA de plasmídeo purificado utilizando um espectrofotómetro de acordo com as instruções do fabricante. Gamas de rendimento típico de 50-1.000 ng / mL. Obter o ADN plasmídico extraído sequenciados através do envio de uma amostra a empresa sequenciação de ADN. Iniciadores de sequenciação devem ser localizado a cerca de 100 nucleótidos a montante e a jusante da região a ser sequenciada; o iniciador de sequenciação para o plasmídeo (ver materiais de plasmídeo) tem a seguinte sequência: ATTACCGCCTTTGAGTGAGC. Nãote: Se houver erro de seqüência ou de recombinação no inserida ndsDNA portões, selecione uma colônia diferente da placa do passo 2.9. Siga os passos de 3,1-3,4 para verificar se as sequências dos portões inseridos estão corretos. Depois de verificar que as sequências estão correctas, escolher a colónia correspondente da placa selectiva de ampicilina (do passo 2.9), e incubar uma cultura de 800 ml de Terrific Broth (TB) contendo antibióticos ampicilina (a uma concentração de 100 ug / mL). Crescer a cultura a 37 ° C durante 16-24 horas com agitação vigorosa (200-300 rpm). TB é particularmente bem adequado para a produção do plasmídeo de elevado rendimento. Nota: Em alternativa, LB também poderia ser utilizado para crescer as bactérias, embora o rendimento de plasmídeo pode ser um problema. Purifica-se o ADN utilizando um kit Maxi-prep seguindo as instruções do fabricante. Siga o passo 3,3-3,4 para verificar se as sequências estão corretas. Se qualquer recombinação ocorreu, consulte a seguinte nota. Caso contrário, passe para o passo 4. <br /> Nota: Um possível problema aqui é que várias cópias de portões inseridos no plasmídeo pode recombinar devido ao reparo do DNA. Para resolver este problema, use um E. estirpe de E. coli sem a proteína recA (uma proteína relacionada com a reparação do ADN), tal como JM109 ou DH5a para transformar um plasmídeo previamente verificada-sequência (ou seja, sem quaisquer erros de sequência e de recombinação). Em seguida, escolher uma colónia desta placa e verificar a sequência do plasmídeo através do envio de uma amostra a empresa sequenciação de ADN. 4. enzimática Processamento Nota: Esta secção descreve o processo para a digestão de plasmídeos de tal modo que eles são cortados e com entalhe nas localizações correctas e pronto para ser utilizado para experiências de cinética. Digerir o ADN do plasmídeo purificado a partir do passo 3.7 com a enzima de restrição PvuII-IC durante 1 h a 37 ° C (ver Tabela 7). Tipicamente digerir o plasmídeo com 4 unidades de PvuII-HF por 1 mg de plasmídeo. Alta fidenzimas de restrição Elity são recomendados para uso, pois reduzem drasticamente cortes inespecíficos. Realizar precipitação com etanol na amostra. Adicionar 2 volumes equivalentes de etanol absoluto arrefecido em gelo para a amostra. Incubar a mistura a -80 ° C durante pelo menos 1 h (esta mistura também pode sentar-se, a -80 ° C durante S / N). Centrifugar a 10,000-14,000 xg à temperatura de 0 ° C durante 30 min. Remover o sobrenadante. Adicionar 1000 mL de etanol a 95% temperatura ambiente com a amostra, e inverter 10-15 vezes. Centrifugar a 10,000-14,000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Remover o sobrenadante e o ar seco no banco durante 10-20 min. Ressuspender os sedimentos de DNA num volume apropriado de nuclease livre H2O (tipicamente 100-200 uL). A adição de mais de 200 uL irá geralmente fazer a amostra demasiado diluída para utilização em experiências de cinética. Medir o DNA ressuspenso usando um espectrofotómetro seguindo o minstruções de ABRICANTE. Digest juntar portões com nicking Nb.BsrDI enzima a 65 ° C durante 1 hora utilizando 4 unidades de enzima por 1 ug de plasmídeo (ver Tabela 8); digerir forquilha portões com nicking Nt.BstNBI enzima a 55 ° C durante 1 hora utilizando 8 unidades de enzima por 1 ug de plasmídeo (ver Tabela 9). Nota: Passo 4.2 remove um tampão de digestão de enzimas e ajuda a concentrar-se as portas para a cinética experiências. Passo 4.2 pode ser ignorada para se juntar portões porque tanto a enzima de restrição PvuII-HF e enzima nicking Nb.BsrDI compartilham o mesmo tampão de digestão. No passo 4.2.8, nuclease livre H2O é utilizado em vez de TE porque o EDTA é um agente quelante para catiões divalentes e podem inibir as enzimas de restrição que necessitam destes iões para funcionar. Nota: A adição de quantidades excessivas de enzimas pode conduzir a quantidades elevadas de vazamento circuito inicial (Figura 4), ​​o que é provavelmente causado por excesso de digestão 46. Esse problema can ser endereçada através da optimização das quantidades de enzimas (ver Figura 4). Gama típica de enzimas é de 1-10 unidades / 1 ug de plasmídeo. 5. Preparação de oligonucleótidos de cadeia simples Nota: Esta secção descreve o protocolo para a ressuspensão e quantificar o ADN de cadeia simples sintetizado quimicamente (ssDNA) que vai ser utilizado para os cordões e fios de sinal auxiliares. Para as sequências de cadeia ver Tabela 10. Note-se que o protocolo seguinte é um exemplo da preparação de 10 uM de ADNcs. Outras concentrações de ADNcs podem ser preparados de modo semelhante. Depois de receber os oligos de ADN fabricante, girar os tubos contendo ADN em 10,000-14,000 xg durante 1 min para garantir que todo o ADN é seco no fundo do tubo. Ressuspender o ADN utilizando 1x Tris ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) tampão (tampão TE: Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 8,0) para alcançar uma concentração final de 100 uM. Paraexemplo, ressuspender 8 nmol de ADN em 80 ul de tampão TE. Misturar 10 ul de DNA a 100 uM com 90 ul de água molecular num tubo de microcentrífuga, que deve alcançar uma concentração final de 10 uM. Medir a concentração exacta da amostra de ADN, utilizando um espectrofotómetro de acordo com as instruções do fabricante. O protocolo a seguir dá um exemplo de como a concentração de ADN pode ser medido. Anule o espectrofotômetro com 2 l de água molecular. Medir a absorvância a 260 nm (A 260) da amostra de ADN. Use a seguinte equação para calcular a concentração de ações. Nota: A concentração da amostra é M = coeficiente 260 / extinção. O coeficiente de extinção pode ser encontrada na especificação folha de dados do fabricante ADN. 6. Preparação da Repórteres fluorescentes Nota: Esta seção descreve oProtocolo para a preparação Repórter C, Outros repórteres fluorescentes podem ser montados de forma similar. Ordem de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) os oligonucleótidos purificados ROX- <c * tc> (a cadeia de cima do Repórter C) e <c> -rq (a cadeia de baixo do Repórter C) a partir do fabricante de ADN (ver Tabela 10 para sequências ). Depois de receber o oligonucleotídeos sintetizados, ressuspender e quantificar amostras conforme explicado na Etapa 5. Misturar o topo repórter e fios de fundo (ou seja, ROX- <c * tc> e <c> -rq) em 1x tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) com Mg 2+ 12,5 mM (ver a Tabela 11 para a receita detalhada ). Note-se que aqui a 30% o excesso de fio quencher rotulado <c> -rq é adicionado para montar o repórter, o que garante que todas as vertentes marcado com fluoróforo apagaram-se mesmo com estequiometria imperfeito. Recozer o complexo de repórter C utilizando um termociclador, arrefecimento de 95 ° C a 20 ° C a uma velocidade de 1 ° C / min. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C. 7. As medições de fluorescência Nota: A secção descreve um protocolo geral para as medições de cinética de fluorescência (ver Figura 5 para o procedimento experimental), e este protocolo irá ser utilizado nos passos 8, 9, e 10. De referir ainda que este protocolo é para a utilização de um espectros luorimetro. Alternativamente, estas experiências também poderia ser realizado num leitor de placas embora as variações de sensibilidade, bem-a-poço e falta de controlo da temperatura em experiências a longo prazo pode ser um problema. Definir o controlador de temperatura a 25 ° C, e esperar que a temperatura estabilize. Utilizando um controlador de temperatura pode reduzir a variabilidade no sinal que podem resultar da variação da temperatura. Definir parâmetros adequados foas medições de cinética r no software de aquisição de dados do espectros. Configurações exemplo detalhado são como se segue: Defina a largura da fenda de 2,73 nm para ambas excitação e emissão monocromadores. Defina o tempo de integração para 10 segundos para cada ponto de tempo de 60 segundos. Defina o tempo total de medição de 24 horas. Definir os comprimentos de onda de excitação / emissão para coincidir com os fluoróforos utilizadas na experiência. Comprimentos de onda Exemplo são como se segue: ROX (588 nm / 608 nm), e TAMRA (559 nm / 583 nm). Adicionar Nuclease livre H2O e 10x tampão de Tris-acetato-EDTA contendo 125 mM de Mg 2+ (10x TAE / Mg2 +) para uma célula de quartzo sintético. Veja as Tabelas 12, 13 e 14, por exemplo, volumes de usar. Adicionar cadeias poli-T para alcançar uma concentração final de 1 uM ~ (ver Quadro 12, 13, e 14 para volumes), e em seguida, vortex o sintéticocélulas de quartzo para 10-15 seg. Geralmente, as pontas da pipeta irá não se ligam especificamente a DNA. A adição de elevadas concentrações de fios de poli-T pode reduzir este erro de ligação não específica. Adicionar repórteres e fios auxiliares. Ver Tabela 12, 13, e 14, por exemplo, os volumes para usar. Note-se que para a calibração repórter, não há necessidade de fios auxiliares. Adiciona-se 10% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) para atingir uma concentração final de 0,15% de SDS. Nota: SDS é utilizado para dissociar os portões de enzimas derivado do plasmídeo por enzimas podem interferir com a reacção de deslocamento de cadeia (ver Figura 6). SDS é recomendado aqui, em vez de desnaturação de enzimas para evitar a dissociação e recombinação incorreta de fios de portão, que podem afetar adversamente a função do circuito. [Saltar este passo para a calibração repórter.] Adicionar juntar e portões garfo (ver Tabela 13, e 14 para volumes)para a célula de quartzo sintético e misturar a solução pipetando-o para cima e para baixo, pelo menos, 20 vezes (não vortex a cuvete porque as soluções vórtex com SDS pode resultar em bolhas que irão afectar as medições de cinética de fluorescência). Além disso, mover-se para os seguintes passos da medição tão rapidamente quanto possível, porque a reacção de vazamento inicia imediatamente após a adição de junção e da forquilha portas para a célula de quartzo sintético. Coloque as células de quartzo sintéticos para a câmara de um espectrofluorímetro. Inicie a medição de cinética. Depois de 5 minutos de medição, adicionar fios de entrada (ver Tabela 12, 13, e 14 para volumes) para a célula de quartzo sintético e misturar a mistura reaccional pipetando-o para cima e para baixo, pelo menos, 20 vezes. Note-se que a amostra deve ser misturada com cuidado para evitar bolhas. Execute esta etapa, enquanto o programa de aquisição de dados está em pausa para evitar medir sinais desencadeada pela externoclaro. Grave a cinética da reacção até atingir o estado estacionário. As cinéticas de reacção são apresentadas no computador. 8. Calibre fluorescentes Repórteres Nota: Esta seção descreve o protocolo para fazer curvas de calibração de repórteres fluorescentes. As curvas de calibração irá ser utilizada para converter unidades de fluorescência arbitrárias ao sinal de concentração molar. Calibrar repórteres fluorescentes seguindo o protocolo descrito no Passo 7. A utilização dos volumes de reagentes e tampões, como resumido na Tabela 12 A concentração padrão para este exemplo é de 50 nM (1x).; repórteres estão em 3x; entrada é 1x. Para os casos em que a entrada <tc c> são a 0,25x, 0,5x, 0,75x, ajustar o volume livre de nuclease H2O correspondentemente para manter o volume final de cada reacção de 600 ul para ser. Um exemplo de dados são mostrados na Figura 7A. Fazer uma curva de calibração doRepórter C por um ajustamento linear dos valores de fluorescência finais contra a concentração inicial do sinal de C (Uma curva de calibração de exemplo é mostrado na Figura 7B). Esta curva de calibração pode ser usado para converter unidades de fluorescência arbitrárias à sua concentração de sinal correspondente. 9. Quantificar a concentração de plasmídeo derivado de ndsDNA portas Nota: Todos os lotes processados ​​independentemente dos portões ndsDNA plasmídeo derivado de resultados com um rendimento diferente de portas funcionais, e esta secção descreve um protocolo para a quantificação da concentração de portões ndsDNA derivado de plasmídeo. Quantificar a concentração de portões ndsDNA derivado de plasmídeo seguindo o protocolo descrito no Passo 7. A utilização dos volumes de reagentes tal como resumido na Tabela 13 Nota:. A Tabela 13 descreve um exemplo de receita forquilha BC quantificação Junte-se. </em> AB e outras portas pode ser realizada de forma semelhante, mas usando diferentes vertentes de entrada, fios auxiliares e jornalistas. Converter o valor de fluorescência final medida neste ensaio a uma concentração de sinal C, utilizando a curva de calibração a partir do passo 8.2. Em seguida, volta a calcular a concentração portão ndsDNA. Por exemplo, um valor de fluorescência final para o experimento de quantificação porta corresponde a 25 nM sinal C (0,5x) com base na curva de calibração na figura 7B. Uma vez que o estoque de forquilha aC é diluído 40 vezes nesta reacção, a concentração de estoque da porta garfos BC é 1 uM. 10. Medições Cinética para a reacção A + B-> B + C Nota: Esta secção descreve um protocolo para testar a realização de ADN de uma reacção química usando formal de medições de cinética de fluorescência. Porcinética do formulário de medição seguindo o protocolo descrito na Etapa 7. Utilização volumes de reagentes e tampões, como resumido na Tabela 14.