3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Stanford University Human proefpersonen en Institutional Review Board protocol goedgekeurd. 1. Articulaire Chondrocyte Isolatie Verkrijgen kraakbeen weefsel tijdens de totale knieprothese weggegooid en ontleden zoals eerder 8 beschreven. Selecteer visueel het mediale of laterale femurcondylen kraakbeen monsters voor gladde oppervlakken en maak snede in het oppervlak van het kraakbeen door een scalpel om 4-5 mm kraakbeen biopsieën verwijderen zonder dat de subchondrale bot. Isoleer chondrocyten van de extracellulaire matrix door enzymatische dissociatie van het weefsel met O / N behandeling met gezuiverd collagenase. Met 1: 1 verhouding van collagenase II (125 U / ml) en collagenase IV (160 U / ml) in chondrocyten groei media bij 37 ° C. De volgende dag, filteren het gedigereerde weefsel dat de gedissocieerde cellen door een 70mm poriegrootte Nylon mesh. Was tweemaal met 20 ml DMEM / F12 en centrifugeer bij 600 g gedurende 5 min. Plaat de geïsoleerde chondrocyten met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / 60 mm kweekschaal na resuspensie in DMEM / F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 25 ug / ml ascorbaat, 2 mM L-glutamine, antibiotica (100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,25 ug / ml fungizon). Laat de platen bij 37 ° C en de primaire chondrocyten kweken als een high-density monolaag houden vóór inkapseling in biomimetische hydrogels. 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication Opmerking: deze methode kan de synthese van een biomimetische hydrogel bevattende poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA) in DPBS. De toevoeging van foto-initiator maakt licht geactiveerde verknoping. De uiteindelijke hydrogelsamenstelling bevat 7% wegent / volume (w / v) van PEGDA, 3% w / v van CS-MA en 0,05% w / v van fotoinitiator. Synthetiseren CS-MA door functionaliseren CS polymeer met methacrylaatgroepen. Bereid gebufferde oplossing van 50 mM 2-morfolinoethaansulfonzuur (MES) en 0,5 M natriumchloride (NaCl) door het oplossen van 1,952 g MES en 5,84 g NaCl in 200 ml gedeïoniseerd water (DIH 2 O). Los in de gebufferde oplossing 5 g chondroïtinesulfaat natriumzout. Voeg 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) en 1,771 g (9,24 mmol) 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (molaire verhouding NHS: EDC = 1: 2) om de oplossing en roer gedurende 5 min. Voeg 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoethyl methacrylaat (AEMA) (molaire verhouding NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) aan de oplossing en de reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur te handhaven. Zuiver het mengsel door dialyse tegen gedeïoniseerd water (DIH 2 O) gedurende 4 dagen via dialysebuizen (12-14 kDa MWCO). Filter de purified oplossing door een 0,22 urn filter en plaats de open buizen met de oplossing in de exsiccator en vacuum O / N. Zorg ervoor dat alle buizen worden beschermd tegen het licht. Bewaar het opgelost polymeer bij -20 ° C beschermd tegen licht en vocht. 3. Cell Encapsulation Autoclaaf de PCR-film en cilindrische staven (voor het ponsen van de cel-beladen 3D hydrogels) en steriliseer de op maat gemaakte cilindrische gel schimmel door onderdompeling in 0,2 urn gefilterde 70% ethanol in weefselkweek kap onder UV-licht. Dicht de onderkant van de gel vorm met geautoclaveerd PCR film zonder luchtbellen of spleten om lekkage te voorkomen. Hou het in een steriele 150 mm plaat. De dag voor celinkapselende in biomimetische hydrogel, dissociëren de high-density chondrocyten monolaag met O / N behandeling Collagenase II en IV Collagenase oplossing. Gebruik 125 U / ml voor Collagenase II en 160 U / ml collagenase VI voor elk in chondrocyten groeimediumbij 37 ° C. Neem een ​​50 ml buis en voeg 5% gewicht / volume (w / v) poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA), en 0,05% w / v fotoinitiator in DPBS. Vortex de buis om de oplossing te mengen en apart houden. Bescherm de buis van licht. Verzamel de gedissocieerde cellen in een 50 ml Falcon buis, tellen en centrifugeer bij 460 xg gedurende 5 min. Zuig alle media uit de cellen buis en voeg de bovenstaande gemengde gel materiaal resuspendeer cellen bij een dichtheid van 15 x 10 6 cellen / ml. Meng het 30 keer grondig terwijl het vermijden van de vorming van luchtbellen. Pipetteer 72 ul van de cel-suspensie hydrogel of hydrogel alleen in de op maat gemaakte gel cilindrische vorm en gelering te induceren door middel van blootstelling aan UV-licht (365 nm golflengte) van 3 mW / m 2 gedurende 5 min. Bereid sommige hydrogel oplossing met geen mobiele content. Met deze constructen als negatieve controles voor de toekomstige biochemische en mechanische testen. Measuopnieuw de intensiteit van het UV licht met een UV intensiteit meter. Om de intensiteit aan te passen, wijzigt u de afstand tussen de UV-lichtbron en de hydrogel schavot tijdens geleren. OPMERKING: Omdat de hydrogel bevat CS, wordt de acellulaire bijdrage afgetrokken van de biochemische GAG ​​inhoud van de cel beladen hydrogels alleen de cellulaire GAG ​​vertegenwoordigen. Gebruik een scalpel om de film voor een eenvoudige schil af te snijden en verwijder deze voorzichtig. Met de hulp van de cilindrische staven, duwen de gel in een 6-wells plaat met 5 ml steriel DPBS te wassen gepolymeriseerde gel en losse cellen. De cultuur van de cel-beladen hydrogels in 24 well platen met 1,5 ml chondrocyten groei media in elk putje. Gebruik een wegwerp spatel om de gewassen hydrogels zetten in de put. Beoordelen levensvatbaarheid van de cellen door levend dood kleuring 24 uur na inkapseling met een levensvatbaarheid / cytotoxity kit. De cultuur van de cel-beladen hydrogels en de lege hydrogels voor 3-6 weken veranderen frisse chondrocyten growth media om de 2 dagen voor de oogst voor de analyses. 4. RNA-extractie en genexpressie analyses Zorgvuldig aspireren de media en zet steriele 1X PBS aan de cellen beladen en de lege controle hydrogels. Met behulp van een steriele spatel, breng elke hydrogel een schone 1,5 ml eppendorfbuisje en voeg 250 ul van Tri-reagens aan elke buis. Volg de instructies van de fabrikant om RNA te isoleren. Na RNA isolatie en kwantificering gebruik 1 ug van het van elk monster en het uitvoeren van een omgekeerde transcriptie in cDNA met behulp van de High Capacity cDNA reverse transcriptie Kit. Voor kwantitatieve PCR gebruiken TaqMan Gene Expression Arrays voor het onderzoek van de expressie van de genen van belang. Normaliseren van de genexpressie niveaus intern GAPDH. Voor de PCR-omstandigheden omvatten een 2 minuten incubatie bij 50 ° C eerdere amplicons met uracil-DNA glycosylase inactiveren, gevolgd door een 1060; min incubatie bij 95 ° C om het Taq polymerase te activeren. Voer veertig PCR-cycli bestaande uit 15 sec bij 95 ° C en 1 min bij 60 ° C. 5. Biochemische Analyses Voor elke cel-hydrogel constructen kwantificeren DNA en gesulfateerd glycosaminoglycaan (sGAG) produceren als volgt. Zorgvuldig aspireren de media en zet steriele 1X PBS aan de cellen beladen en de lege controle hydrogels. Weeg een lege tube en zet de hydrogel binnenkant na deppen het op zijdepapier en registreer het gewicht of natte gewicht van de hydrogels. Bevries elk hydrogel bij -20 ° C in een afzonderlijke 1,5 ml eppendorfbuisje voor enzymatische digestie en later gebruik van een aliquot van het verteerde product Picogreen-test (DNA) en dimethyl-methyleenblauw assay (voor GAG) in werking. Bereid de papainase oplossing enzymatische digestie van de hydrogels. Maak eerst de PBE buffer door weging uit 7,1 g natrium Phosphate dibasisch (Na 2 HPO 4) en 1,6 g ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout (EDTA-Na 2). Oplossen in 500 ml dH 2 O, de pH op 6,5 en filtreer de gezuiverde oplossing door een 0,22 mm filter. Oplossen in 20 ml PBE buffer 0,035 g L-cysteïne. Filtreer de oplossing en 100 ui steriel enzym papaïne. Als direct de assays, neemt de buizen van -20 ° C en voeg 300 ul van het gereed papaïne oplossing van het bevroren hydrogels. Plet de gel met een vijzel en stamper en meng het goed met de motor stamper. Breng het volume tot 500 ul met extra papaïne oplossing. Voer dezelfde procedure voor de controle gels. Incubeer bij 60 ° C gedurende 16 uur 3,9. De oplossing die het gedigereerde hydrogel kan daarom gebruikt voor DNA kwantificatie en GAG. De DNA-inhoud met de Picogreen test met Lambda faag DNA als standaard volgende pr fabrikant metenotocol. Kwantificeren van de gesulfateerde GAG-inhoud met behulp van de 1,9-dimethylmethyleen blauw (DMMB) kleurstof bindingstest met haai chondroïtinesulfaat standaard 10. Bepaal het GAG gehalte in de hoeveelheid GAG delen voor de overeenkomstige natgewicht. 6. Mechanische Testen Voeren onbeperkte compressie testen met behulp van een Instron 5944 testsysteem uitgerust met een 10 N load cell. Nadat de gewenste dagen in vitro cultuur, voert u de compressie-test op de mobiele-hydrogel schavot en de acellulaire controle hydrogels. Dompel de monsters in PBS bad bij kamertemperatuur en te comprimeren met een snelheid van 1% rek / sec tot een maximale rek van 15% 11,12 omdat de lichamelijke belasting ervaren door kraakbeenweefsel onder belastingstoestand is gerapporteerd 10-20% te zijn 13,14. Maak spanning vs. rek bochten en curve fit met behulp van een derde orde veeltermvergelijking. Bepaal de compressive tangent modulus van de kromme passende vergelijking ten rekwaarden van 15%.