Summary

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

Published: August 07, 2015
doi:

Summary

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Abstract

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Introduction

In der Augenheilkunde hat die Gentherapie als Behandlungsmethode in monogenen geerbt Retinopathien entstanden. Es vererbt Retinopathien mit Genen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Leber angeborene amurosis 1,2, Retinitis pigmentosa 3 und choroideremia 4 verbunden. Das Forschungsfeld der Gentherapie erweitert in beiden präklinischen Studien und klinischen Studien unter Verwendung von viralen Vektoren, wie Adeno-assoziierte Virus (AAV), Lentiviren (LV) und Adenovirus (Ad) 5. Verschiedene virale Vektoren haben unterschiedliche Tropismus in der Netzhaut. Für eine sichere und wirksame Gentherapie, virale Vektoren sollten sorgfältig entsprechend Zielzellen und Zielgene ausgewählt werden.

Die Route der Genübertragung ist auch wichtig für eine effektive Genübertragung an Zielzellen, so sollte es sorgfältig und ausgewählt werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur intraokularen Abgabe von viralen Vektoren sind SUBRETinal Einspritzung und intravitreale Injektion 6. Letztere, intravitreale Injektion, wurde weit verbreitet für die Arzneimittelabgabe verwendet werden, um CNV in feuchten altersbedingten Makuladegeneration (AMD) und Makulaödem bei diabetischer Retinopathie 7 behandeln. Intravitreale Route bietet Exposition viraler Vektoren zu glasigen und inneren Retina, sondern die Diffusion der Vektoren äußeren Netzhaut begrenzt ist. Auf der anderen Seite stellt die subretinale Route direkte Lieferung von viralen Vektoren zum Potential Raum zwischen Retina und RPE, Induzieren einer lokalisierten Bläschen. Daher wird subretinalen Injektion momentan als ein effizienter Weg für die gezielte Photorezeptorzellen und RPE. In Bezug auf die chirurgischen Ansatz, Pars plana als einen sicheren Bereich für die intravitreale Injektion gewählt, um Netzhautschäden in menschlichen Patienten zu vermeiden. Durch einfaches Ändern dieses Konzept für Mäuse, wir könnten virale Vektoren subretinal oder intravireally via Limbus-Ansatz zu injizieren.

In diesem VideoArtikel zeigen wir eine einfache und bequeme Methode der subretinalen Injektion von viralen Vektoren in Mäuse RPE. Nach Einzelpunktion bei posterior zu Limbus mit einer 30 G 1/2 Nadel wird ein 33 G stumpfen Nadel ausgestattet Mikroliterspritze in den subretinalen Raum über den Limbus Einstichstelle eingeführt. Die viralen Vektoren 1,5-2 ul Volumen auf das Potential Raum zwischen Retina und RPE Induzieren subretinalen Bläschen injiziert. Dieser Vorgang kann unter direkter Sicht mit Operationsmikroskop durchgeführt werden. Wiederholte Praxis werden reproduzierbare Ergebnisse auch ohne direkte Visualisierung der Bläschenbildung zu gewährleisten. Dies soll dazu dienen, um eine genaue und zeitsparende Experimente zur subretinalen Gentransfer in Mäusen RPE durchzuführen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und die Richtlinien und Vorschriften von der Seoul National University Institutional Animal Care und Verwenden Committee und Seoul National dargelegt Universitätsklinikum Biosafety Committee. 1. Vorbereiten Injection Kit und Virale Vektoren Bereiten Sie die Mikroliter-Spritze mit einer 33 G…

Representative Results

Um die Wirksamkeit der subretinalen Injektion auf virale Gen-Transduktion durch dieses Protokoll zu bewerten, haben wir im Handel erhältlich LV Vektoren mit CMV-Promotors exprimieren, sowohl GFP und RFP für den Indikator. Augen wurden nach der jeweiligen Zeitperiode nach dem Forschungszweck ausgeschält. Für die repräsentative Ergebnisse wurden die Augen 10 Wochen und 20 Wochen nach der subretinalen Injektion enukleiert. Nach vollständiger Entfernung der Netzhaut mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Wohnu…

Discussion

In diesem Video-Artikel beschrieben wir die Limbus-Ansatz subretinalen Injektionstechnik im Detail mit den repräsentativen Ergebnissen der RPE / Aderhaut / Lederhaut Flachmontage. Dies ist eine einfache und bequeme Technik zum subretinalen Injektion von viralen Vektoren in RPE. Direkte Visualisierung bleb Bildung während der Injektion ist ein wichtiger Schritt für die pünktliche Lieferung für die Anfänger. Es gibt einige subretinalen Injektionstechniken in Blatt eingeführt of Visualized Experiments 8-10.</su…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von der Seoul National University Research Grant (800-20140542) unterstützt, der Pioneer Research Program der NRF / MEST (2012-0009544) und die Bio-Signalanalyse-Technologie-Innovations-Programm der NRF / MEST (2009-0090895), und die Gewährung von NRF / MEST (2015M3A9E6028949).

Materials

TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS WPI 500233
VANNAS Scissors S/S, 105mm WPI 555583S
33G Blunt needle WPI NF33BL-2
NanoFil Syringe, 10 microliter  WPI NANOFIL
RPE-KIT WPI RPE-KIT For easy one hand injection
30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle BD 305107 Initial puncture for subretinal injection
Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) Warner Instruments 64-0720  (CS-3R)
Leica operating microscope Leica LM M80
Fluoresecein microscope Nikon Eclipse 80i
Lentivirus Thermo scientific TMO.LV-Ctr Used to dilute vectors
PBS Gibco 10010-015 Used to dilute vectors
Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) Hanmi For dilation
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) Bausch&Lomb For topical anesthesia
Healon GV OVD Abbott Medical Optics Inc.
Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) Virbac For general anesthesia
Rompun® injection (Xylazine HCl) Bayer For general anesthesia

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030, doi:10.3791/53030 (2015).

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