JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em> דרוזופילה</em> עוברים

Published: September 10, 2015
doi:
10.3791/52985
, , , ,
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Abstract

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Introduction

ההבנה כיצד תאי רכישת נכסים ספציפיים במהלך הפיתוח היא חיונית על מנת להעריך את המורכבות של איברים והתפתחות הפוטנציאל שלהם כלפי מצבים פתולוגיים. יש דחיפת מחקר גדולה לפענח את רשתות הרגולציה הגן שנמצאות בבסיס מפרט תא והתמיינות של פרופילי ביטוי גנים הגלובליים גילו דבר, מעמד מחייב פול השני, תפוסת תמלול בגורם על רצפים רגולטוריים או לאחר translational שינויים של ההיסטונים.

כדי להעריך ביטוי גנים בmicroarrays רמה הגלובלי וגישות RNA-seq משמשות. Microarrays יאפשר לזהות שפע mRNA, ואילו RNA-seq הוא טוב יותר מותאם להלשנה על הסוגים השונים של RNAs כוללים קידוד וnoncoding RNAs כמו מיקרו-רנ"א, lncRNAs או snRNAs. עם זאת, טכניקות אלה לא יכולים להבדיל באופן פעיל-עיבד, מצב יציב mRNA, פעיל-תרגום mRNA, וmRNA כניסה לתהליך הפירוק. מדידה יציבה-st אכלתי רמות ה- mRNA ידוע להיות הערכה לקויה של הרכב proteome 1-3. בניגוד, זיהוי באופן פעיל-תרגום mRNA נותן תמונה מדויקת יותר של ייצור חלבון.

עם זאת, מחקרי transcriptomic היו בעיקר הובילו ברמה כל-אורגניזם על ידי השוואת רווח או הפסד של פונקציה של גורם ספציפי למצב בר-סוג 4-7 או על רקמה גזור, מה שהופך את פרופילי ביטוי גנים קשים לפרש. התקדמות בכלי תא מיקוד, טיהור זיקה ושיפורי רגישות מאפשרת כעת לבצע הגנום מנתח באוכלוסיות קטנות של תאים או תאים בודדים אפילו באורגניזם חי.

בדרוזופילה, אוספים גדולים של קווים מהונדסים יאפשר מיקוד של זמן ומרחב ספציפי של רקמות שונות ותת-אוכלוסיות תאים באמצעות מערכת GAL4 / כטב"מ 8-10 מניב כימות מדויק יותר של המנגנונים המולקולריים הנדרשים לתפקוד תא.

<p clהתחת = "jove_content"> בין גישות חדשות שפותח על ידי חלוקה polysome פרופיל תואר כדרך כדי ללכוד באופן פעיל-תרגום 11 RNA. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה שיפוע סוכרוז מאפשרת הבחירה של חלק polysome ונחישות של mRNA מתורגמת הגנום כאשר ניתחו עם microarrays או רצף עמוק. Polysome בידוד יכול להיות בשילוב עם מערכת עיכול nuclease לזהות עקבות ריבוזומלי המתאימות לברי RNA מוגנים על ידי הריבוזומים במהלך תהליך התרגום 12. footprinting ריבוזומלי מגדיל את הדיוק של כימות תרגום RNA ורזולוציה ברמת רצף RNA ומיצוב הריבוזום, מאפשר למדוד שיעור של תרגום. עם זאת, עד היום לא הוחלו על בידוד תא ספציפי של translatomes, בעיקר כתוצאה מהירידה החזקה בתשואת RNA המתקבלת בסופו של תהליך footprinting הריבוזום. בהתחשב בכך שבחירת הגודל של RNA עשויה ליצור שקר-p פוטנציאלositives מRNPs שונה שיכולים להיות גם הגנת RNA באופן דומה, יש צורך בהתפתחויות נוספות כדי לשפר את footprinting ריבוזומלי ולהתאים אותה לגישות תא ספציפי.

אחת שיטות כגון, נקרא תרגם ריבוזום הזיקה הטיהור (TRAP) תוארה בשנת 2008 על ידי היימן ואח '. ומיושם לבודד את translatome מקבוצת משנה של תאי עצב בעכברים. על ידי epitope תיוג חלבון ריבוזומלי באופן תאים מסוג ספציפי, polysomes יכול להיות מטוהר באופן סלקטיבי ללא צעד מייגע של ניתוק תא ומיון. במקרה זה, בשנתי ה -60 חלבון ריבוזומלי L10a על פני השטח של הריבוזום הייתה מתויגת עם 13 eGFP. מאז 2008, מספר מחקרים השתמשו בשיטה זו במינים שונים, מעכברי 14-19 לX. laevis 20,21, 22,23 דג הזברה וארבידופסיס thaliana 24. שיטת המלכודת גם הותאמה למודל תסיסנית ומשמשת לפוריםתאים מהסוג ספציפי פ.י. mRNAs מהתאים עצביים 25 והאסטרוציטים 26. מערכת GAL4 / כטב"מ בינארי צדדי שימשה להביע RpL10A GFP מתויג באופן רקמות ספציפיות. ראשי הזבובים בוגרים נותחו לבצע בחירת polysome מהתאים עצביים (ממוקדים על ידי נהג Elav-Gal4 פאן-עצבי) וRNAs המבודד היו רצף. המספר הגדול של גנים מוסדרים עד תואם לאלה ידועים להתבטא במערכת העצבים, המצביע על כך שיש הגישה ספציפיות טוב וגרם לנו להתאים אותו לאוכלוסיות תאים נדירות (פחות מ -1% של תאים) נוכחי בפיתוח עובר תסיסנית .

בתוך מודל דרוזופילה, השלב העוברי הוא מודל של בחירה לחקר תהליכים התפתחותיים, כשחקנים המולקולריים ותנועות המוךפו"גנטי נשמרים אבולוציונית. גישות transcriptomic רקמות ספציפיות בלבד שנערכו עד כה במודל זה בוצעו באמצעות סלולארי או גרעיני כךrting והיה מסוגל ללמוד transcriptome מצב יציב 27-31 בלבד, יצירת צורך בשיטות מוקדשת לרקמה / פרופיל translatome תא ספציפי בעובר הזבוב. כאן אנו מדווחים פרוטוקול המלכודת הראשון מוקדש לעוברי תסיסנית. בשיטה זו, העוסק ב-התרגום mRNA באוכלוסיית תא מוגבל מאוד של כ -100 תאי שריר לכל עובר היה מבודד בהצלחה עם איכות וסגוליות גבוהים. GAL4 / כטב"מ המערכת בינארי משמשת לנהוג הביטוי של RpL10A מתויג GFP בתת-אוכלוסייה של שרירים ללא כל רעילות, אין פנוטיפים לכאורה או עיכוב התפתחותי, כפי שמוצגים בעבר 25. עובר תסיסנית יש 30 שרירים לhemisegment שיהיה להצמיח השרירים של הזחל. על ידי שימוש באזור רגולטורים גילו בסביבה של גן זהות נמושה, 6 מתוך 30 השרירים רב-הגרעיניות ממוקדים. ב assay זה, הריבוזומים הם משותקים על mRNA באמצעות התארכות התרגוםמעכב cycloheximide. תמציות cytosolic משמשות לאחר מכן לטיהור זיקה עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדן ה- GFP. איכות של RNA מטוהר קבלה תוקף באמצעות bioanalyzer. שעתוק לאחור PCR (RT-qPCR) שימש כדי לקבוע את הספציפיות ורגישות של בידוד mRNA והוכיח כי הפרוטוקול מותאם שלנו הוא יעיל ביותר.

Protocol

1. דור קו Fly צור שני מבנים שונים. במבנה הראשון, RpL10A cDNA (מקטע חלבון ריבוזומלי L10a) הוא משובט במורד הזרם של ה- GFP לפלסמיד pUASP-PL-GFP-Nter (שונה מגרסה 32). השימוש בתאי מין אמרגן מאפשר שימוש רב ערכי יותר של הקו המהונדס. הערה: קבל המבנה השני על ידי שיבוט רצף הרגולציה נהיגה ביטוי רקמות הספציפיות של גן נמושה במעלה הזרם של GAL4 (TF) באמצעות פלסמיד pPTGAL4. להזריק פלסמידים בנפרד לw 1,118 זבובים והכניסו בונה לתוך הגנום הזבוב על ידי החדרת P-יסוד (על פי נוהל סטנדרטי) 33. transformants בחר כדי לשחזר קווים לטוס עם בונה על שני כרומוזומים שונים. קו המלכודת הסופי נוצר על ידי שילוב של שתי שורות אלה (צלבים גנטיים) על מנת לקבל קו יציב כפול מהונדס אחד. F0: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב"מ EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx להתראות, ביל; ארגון הנוער הקתולי / scu; נמושה Gal4 / TM6B. F1: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב"מ EGFP :: RpL10A; נמושה Gal4 / TM6B. מסיבי להגביר את הקו הזה ולאסוף את העוברים הרצויים-מבוימים. אוסף 2. העובר הכן 8 כלובי אוכלוסייה גלילית גדולים המכילים כ -40 גרם של זבובים צעירים לכלוב (סביב 180,000 זבובים / כלוב). להמשיך עם מה שנקרא מראש Lays-המאפשר זבובים כדי לנקות עוברים מתפתחים מoviducts. לשם כך, להניח את הזבובים לשעה 1 בשני מנות 11 סנטימטר פטרי בקוטר המכילות תערובת של מיץ הענבים ואגרו הקרושה ולכסות ⅓ של פני השטח עם שמרים להדביק טרי מתוצרת. לאחר 3 חילופי ענבי צלחות מיץ לאסוף את העוברים האמיתיים על צלחות טריות דומות. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לזמן-חלון התפתחותית למד. הסר צלחות מכלובים ולהשאיר אותם באותה הטמפרטורה לזמן הדרוש כדי להשיג שלב ההתפתחותי נכון (לדוגמא, 3 שעות של הטלת ביצים + 10 שעות של addit הדגירה ional נותנת עוברים משלב 10-13 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL)). Resuspend תוכן הצלחת (עוברים, שמרי רסק, זבובים מתים) עם 50 מיליליטר של מים בעזרת מברשת. לעבור סדרה של מסננות (700 מיקרומטר, 355 מיקרומטר, 112 מיקרומטר) כדי להפריד בין עוברים מזבובים מתים וחלקי גוף שנותרו ולאסוף עובר שמר על המסננת קטנה יותר בקוטר, ולאחר מכן לשטוף במים ללא יונים בקצרה. אין להשתמש יותר מ 18 צלחות לאוסף כפי שהוא יכול לסתום את מסננים. עובר dechorionate באקונומיקת 4.5% במים ללא יונים למשך 2 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים במשך 30-60 שניות. דגירה עובר בPBS Tween 0.01% 20, 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide, למשך 5-10 דקות ב RT תחת תסיסה. עוברים יבשים על גיליונות סופגים תאית ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. לשקול את הצינורות ופלאש להקפיא את העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי. בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים המיובשים במשך כמה חודשים ב -80 ° C. <p class = "jove_title"> 3. הכנת חרוזים מגנטיים מצמידים את ה- GFP הנוגדן ביסודיות resuspend החלבון G חרוזים מגנטיים בבקבוק המקורי על ידי תסיסה עדינה. העברה 90 μl של חרוזים לצינור RNase ללא ולאסוף אותם על מגנט (30-60 שניות). 90 μl של חרוזים יש צורך לבצע immunoprecipitation (IP) עם 1 מיליליטר של lysate המכיל 60-80 מ"ג / מ"ל ​​חלבונים. מכבד את היחסים כדי למנוע הרוויה חרוז. השתמש בכמה צינורות פי כמות חלבון. לשטוף חרוזים עם 1 × PBS 0.01% Tween (μl 500) 20 ולאסוף חרוזים על המגנט ללהשליך supernatant. הוסף 30 מיקרוגרם של נוגדן ה- GFP ב350 μl של PBS Tween 0.01% 20 לחרוזים ודגירה עם הסוף איטי לעומת סוף הערבוב במשך 30 דקות ב RT. לאסוף חרוזים על המגנט (30-60 שניות), להשליך supernatant ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome (Hepes 10 150 מ"מ, MgCl 2 5 מ"מ, 0.5 מ"מ DTT, טריטון 1%, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר מ"מ, KCl , Protease מעכב 1 ×, מעכב RNase 100 U). לאסוף חרוזים על המגנט ולהוסיף 500 μl של חיץ חסימה (BSA 0.1 מיקרוגרם / μl, שמרי tRNA 0.1 מיקרוגרם / μl, גליקוגן 0.1 מיקרוגרם / μl במאגר חילוץ polysome). דגירה של 30 דקות ב RT וחזור על שלב זה פעם אחת עם חיץ חסימה טרי. לאסוף חרוזים על המגנט ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome, אז להיזכר חרוזים ולהמשיך מייד לשלב immunopurification (סעיף 6). 4. הכנת lysate לפני שמתחיל, להגדיר את התכנית במטחנת חרוזים מהירות מהירה רב כיוונית: 2 × 10 שניות ב 5000 סל"ד, הפסקה 15 שניות. העברת עוברים מיובשים (1.5 גר ') ל- 15 מיליליטר צינורות prechilled על קרח המכיל מאגר מיצוי polysome, וhomogenize מייד. Homogenize 1.5 גרם של עוברים ב 4 מיליליטר של חיץ חילוץ polysome. עוברי התפשטות הומוגני בשתי prechilled 2 צינורות מ"ל ולטחון את אמברימערכת הפעלה על-ידי הפעלת תכנית homogenizer. העבר את lysate לתוך צינורות microcentrifuge prechilled טריים על קרח ולהכין supernatant פוסט-גרעינית ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 g. העברת supernatant לצינור microcentrifuge prechilled טרי על קרח, להוסיף 1/100 נפח דגימה של 10% Nonidet P-40 לsupernatant (הריכוז סופי = 0.1%), ולערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך. דופק צנטריפוגות המדגם בminifuge לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור, להוסיף 1/9 נפח דגימה של (ריכוז סופי 300 מ"מ 1,2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) = 30 מ"מ ), לערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך, ודגירה את התערובת על קרח למשך 5 דקות (תערובת על ידי היפוך מספר פעמים במהלך דגירה). הכן את supernatant לאחר המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20,000 ז. למדוד ריכוז חלבון בשיטה ברדפורד: הריכוז בlysate צריך להיות בין 60-80 מ"ג / מיליליטר. Tמתקין supernatant לצינור microcentrifuge טרי חדש prechilled ולהמשיך מייד לשלב טרום הקליטה (סעיף 5). 5. טרום קליטה ביסודיות resuspend חרוזים המגנטיים על ידי תסיסה עדינה ולהעביר 30 μl של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge ב RT (30 μl של חרוזים / 1 מיליליטר lysate העוברי). לאסוף חרוזים על המגנט, פיפטה את supernatant, וresuspend חרוזים במאגר polysome חילוץ (500 μl). לאסוף חרוזים על המגנט, להוסיף lysate העוברי, ודגירה עבור שעה 1 ב 4 ° C על הכתף. הסר חרוזים ולשמור supernatant על קרח לצעד immunopurification. לפני immunopurification, לשמור של supernatant 100 μl (קלט) כדי להשוות מדגם RNA העולמי עם מדגם RNA שנאסף לאחר immunopurification, על ידי RT-qPCR למשל. 6. Immunopurification הוסף 1 מיליליטר (המקביל ל 60-80 מ"ג / מיליליטר חלבון) שלטרום נקלט lysate לצינור RNase ללא מכיל 90 μl של חרוזים חסומים מצמידים את נוגדן ה- GFP. דגירה הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם ערבוב הסוף-על-סוף עדין במסובב צינור. לחלופין, לבצע O הדגירה / N ב 4 ° C. לאחר דגירה, לאסוף חרוזים על המגנט. השתמש בminifuge לספין למטה חרוזים, אז resuspend אותם 500 μl של חיץ לשטוף (Hepes 10mm, 350mm KCl, MgCl 2 5 מ"מ, Nonidet P-40 1%, DTT 0.5 מ"מ, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר, RNase מעכב 100 U ) ולאסוף אותם על המגנט. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. לשנות את חרוזים לצינור RNase ללא prechilled חדש ולשטוף פעמיים. לאסוף חרוזים על מגנט ולהמשיך למיצוי RNA על ידי הוספת 1 מיליליטר Trizol ישירות לחרוזים ולעקוב אחר הוראות היצרן. 7. RNA ניקוי והערכת איכות השתמש בערכת RNeasy מיקרו לפי הוראות היצרן. בסיום, elutRNA דואר עם (x) μl מים RNase חינם. חם למשך 2 דקות ב 60 ° C, וחנות snap-קפוא דגימות ב -80 ° C. לבדוק את איכות RNA באמצעות bioanalyzer (אחרי הוראות היצרן). כדי לבדוק את הספציפיות של RNA TRAPed, לבצע שעתוק לאחור על 3 ננוגרם של RNA המטוהר (קלט ו- IP) על פי הוראות היצרן (עילי III). השתמש בcDNA שהתקבל עבור qPCR באמצעות ערכות פריימר גן ספציפי.

Representative Results

המערכת הגופנית עוברי תסיסנית השריר מורכבת של 30 שרירים לhemisegment, ויש לו כל שריר קבוצה מסוימת של מאפיינים: קוד של גני הזהות, עמדה, מספר אירועי היתוך, אתרים מצורפים ועצבוב. זיהוי mRNA המתורגם בתת-קבוצת שרירים ספציפית ייתן מידע על החלבונים הדרושים ליצירת מאפייני שרירים הספציפיים אלה. שימוש בשיטה מבוססת המלכודת, RNA מתת-אוכלוסייה של שרירים המבטאים את גן נמושה זהות הייתה מטוהר (1A-B איור). דאגה עיקרית של גישה זו היא באיכות והספציפיות של RNA הבודד. הפרוטוקול מותאם דיווח כאן אפשר התאוששות שיטתית של RNA באיכות גבוהה העריך עם ניתוח bioanalyzer. מופעי הפרופיל הושגו שום השפלה של RNA (איור 1 ג). במחקרים אחרים התפתחו סביב שיטת המלכודת, הועלו שאלות על הספציפיות של נתונים. כאן אנוmprove השיטה לדכא רקע קשור לאינם ספציפי מחייב של RNA לחרוזים או הצינורות ועל ידי אופטימיזציה של החיץ לשטוף. על מנת להעריך את רמת הרקע ויעילות של בידוד תאים לבטא-נמושה, שהובלנו ניסויי RT-qPCR על 3 חזרות של אותו השלב עוברי. מקפלים-מוספים של 4 גנים שונים (mef2, נמושה, פרוספרו, soxNeuro) חושבו בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32 (1D איור). תוצאות אלו הראו העשרת 2.3-פי של mef2 גן פאן-שרירי והעשרת 5.6-פי של גן נמושה. לעומת זאת, שני גנים המתבטאים במערכת העצבית היו מדולדלים בהשוואה לקלט. ערכי שינוי קיפול מאוד דומים נצפו על 3 משכפל ביולוגי, הוכחה כי הפרוטוקול הוא איתן. עם נהג נמושה-Gal4 ומתחיל עם 1.5 גר ', סביב 1.5×10 ^ 6 עוברים התקבלו המכילים 100 תאי GFP / עובר (כוללת של 150 × 10 ^ 6 חיובייםתאים). לאחר הפעלת ניסוי המלכודת, התשואה היא סביב 25-45 ננוגרם של RNA המסוים תלוי בשלב של עניין. חומר זה הוא מספיק כדי להפעיל ניתוח microarray או RNA-seq באמצעות פרוטוקול הגברה לבנות ספריית RNA-seq. יעילות תהיה תלויה במידה רבה בכוחו של הנהג נהג להביע RpL10A-EGFP. איור 1. איכות והערכה ספציפי של RNA-מבודד מלכודת מנמושה-GAL4> עוברי UASRpL10A-EGFP. (AB) תמונות Confocal של עובר בשלב 16 מראה ביטוי RpL10A-EGFP במיוחד בששת תאי שריר נמושה לhemisegment (). שיתוף לוקליזציה של RpL10A-EGFP עם Beta3tubulin סמן שרירים הכללי הוא ציין בתמונת מיזוג (B). בקרת איכות של TRAPed RNA ע"ר (C)n על bioanalyzer מראה יושרה מושלמת של 18S rRNA ו -28. ניתוח (ד) RT-qPCR מראה סגוליות גבוהה של ניסויי mRNA-מבודד TRAP על 3 משכפל ביולוגי של שלב-16 עובר. מקפלים שינוי מחושב בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32. תמלילי Mef2 נוכחים בכל שושלות השריר הם מועשרים-2.3-פי השוואה לקלט ואילו תמלילי נמושה מוגבלים יותר הם 5.6-מועשר פי. תאים עצביים להביע פרוספרו וגני soxN מתרוקנים 2.2 פי 5.5 ופי בהתאמה. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של תרגום ריבוזום זיקה טיהור (המכונה "מלכודת-RC ') מוקדש למחקר של אוכלוסיות תאים נדירות בעוברי תסיסנית. מידע מסופק על השלבים העיקריים לבידוד מוצלח של RNA הספציפי עם תשואה המתאימה לmicroarray או ניתוח RNA-seq, כלומר כמות, 1) של חומר ביולוגי הנדרש והליך מותאם לתמוגה עובר וחילוץ polysome; 2) חרוזים / נוגדן לlysate יחסים לimmunoprecipitation האופטימלי; 3) על שלבים המאפשרים הפחתה של רקע כולל הרכב חיץ לשטוף כדי להריץ ניסויי מלכודת RC עם סגוליות גבוהות ורגישות.

פרוטוקול זה מניב נתונים לשחזור שהופכים אותו בקלות מיושם על כל סוגי תאים אחרים. טכניקה זו מאפשרת לנתח ביטוי גני ההפרש ברמה של mRNA באופן פעיל-תרגום ובכך לסלול את הדרך להבנת ביטוי חלבון במפרט סוג תא ific בחלון זמן מסוים. שים לב, עם זאת, שפע חלבון יהיה תלוי בקצב של תהליכי התרגום והשפלה. מגבלה עיקרית של שיטת המלכודת היא חוסר יכולתה למדוד את תכולת חלבון באופן כמותי מדויק או לזהות שינוי שלאחר translational. שיפור הכימות על ידי מדידת צפיפות הריבוזום לאורך גוף mRNA ו, בכך, באופן תאים מסוג ספציפי יכול לעשות TRAP בשילוב עם הריבוזום footprinting כלי רב עוצמה. במאמר האחרון 34, השילוב הזה בוצע בכליות 293 תאים עובריים אנושיים. המחברים רצו footprinting nuclease אחרי טיהור זיקה של טופס biotinylated מושרה של RpL10A באמצעות חרוזים streptavidin. זוהי הוכחה של עיקרון כי ניתן לבצע footprinting הריבוזום בהאורגניזם כולו תוך מיקוד סוג תא מסוים, ההגבלה להיות כמות החומר ביולוגי הנדרש לצורך.

"> ביצוע ניסויי TRAP במקביל לניתוחי transcriptomic הגלובליים יאפשר לעקוב אחר פרופורציות בין חדש-עיבד וactively- תרגום RNA. זה יהיה מאוד אינפורמטיבי של המנגנונים שלאחר התעתיק הפוטנציאליים מתקיימים בהקשרים התפתחותיים ספציפיים או אוכלוסיות תאים ספציפיות מיקרו-רנ"א -by למשל.

לסיכום, TRAP הוא שיטה יעילה ביותר, ספציפית ורגישה לזיהוי RNAs חייב ריבוזומים פעילים-תרגום באופן ספציפי בתא. בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של יצורים וסוגי רקמות. פרוטוקול מלכודת RC החדש שתואר כאן היה מותאם לאוכלוסיות נדירות של תאים (פחות מ -1% ממספר כולל של תאים) ולכמות חומר סופי מספיקה לניתוחים שלאחר מכן ברמה כל-הגנום.

מגבלה אפשרית של שיטה זו היא הדרישה של נהג חזק כדי לייצר ריבוזומים מתויגים בכמות מספקת לcompete עם לא מתויגים אלה אנדוגני בסוג התא הממוקד. במחקר שנערך לאחרונה 25, מחברים מוערך 10-30% היחס מתויג לעומת הריבוזומים לא מתויגים.

כדי להתגבר על בעיה זו הגדלת מספר עותק-EGFP כטב"מ-RpL10A צריך לשפר באופן משמעותי את האיזון הזה. לחלופין, הוספה לרקע הגנטי תאר transgene כטב"מ-GAL4 תגביר את הייצור של חלבון GAL4 ובעקיפין להגדיל ביטוי של RpL10A-EGFP. זה צריך להעדיף התפוסה טובה יותר של ריבוזומים מתויגים על mRNA.

שים לב שגישה יעילה כבר זה יכול להתבצע אפילו יותר חזק על ידי התאמת שיטות משלימות להביא היבט הכמותי יותר או לגלות ולפענח מנגנונים מולקולריים שהם חיוניים לשליטת ביטוי גנים.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

Materials

HEPES Sigma  H4034-1006
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850306P
Glycogen thermo scientific  R0561
Purified BSA 100X  Biolabs B9001
Yeast tRNA  Sigma R5636
Super RNase In  Ambion AM2694
Antibody GFP clone N86/38 UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated 75-132 
Nonidet P40  Roche 11754595001
Precellys 24 Lysis homogenisation  Bertin Technology
Nuclease free water  Nalgene
Dynabeads ProteinG Invitrogen 10004D
Potassium chloride (KCl) Applied Biosystem  AM96406
Magnesium Chloride (MgCl2)  Applied Biosystem  AM95306
Cellulose waddin unbleached  VWR 115-2597 
Sieves 112, 355, 710 um  Retsch
TRiZol  Invitrogen 15596-018
MagRack 6 GE HealthCare  28948964
Low binding filter tips  ClearLine
Rnase free tube 1,5 mL  ClearLine 390689DD
Tween 20  Fischer Bioreagent  BP337-500
Cycloheximide  Sigma  C1985
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free  Roche 11836170001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
  7. Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
  17. Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
  18. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
  20. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
  25. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
  26. Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

Tags

TRAPTranslating Ribosome Affinity PurificationRare Cell PopulationsDrosophila EmbryosMRNA TranslationCell-type-specificTranslatome AnalysisPolysomesTagged Ribosomal SubunitDevelopmental ProcessesDisease ProgressionCell-specific Gene ExpressionMicroarrayRNA-seqGal4/UAS SystemMuscle Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (103), e52985, doi:10.3791/52985 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image