JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

Published: October 23, 2015
doi:
10.3791/52970
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Tufts University, 2Department of Pediatrics,University of Connecticut Health Center & Connecticut Children’s Medical Center

Summary

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Abstract

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CNS) יכולה להיות מושפעת ממגוון רחב של הפרעות מעורבות כלי דם, מבניים, תפקודי, מדבקות או ניוונית. 6.8 מיליון אנשים מתים בכל שנה כתוצאה מהפרעות נוירולוגיות, המייצגת את נטל כלכלי-חברתי גובר בעולם 1. עם זאת, יש לי רק מעטים מן ההפרעות טיפולים זמינים. לכן, יש צורך קריטי לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות לחולים הסובלים מהפרעות נוירולוגיות. למרבה הצער, תרופות ממוקדות במערכת העצבים המרכזית רבות נכשלות במהלך ניסויים קליניים, בין שאר בשל השימוש במודלים לקויים פרה-קליניים מחקר, אשר אינו מאפשרים הערכה של השפעות אקוטיות וכרוניות עם קריאות פונקציונליות מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיות.

למרות מאמצי מחקר משמעותיים בעשורים האחרונים, יש כמות עצומה לא ידועה על המבנה והתפקוד של מערכת העצבים המרכזית. על מנת לקבל יותר ידע, מודלים של בעלי החיים הם לעתים קרובותאד מודל מצבים פתולוגיים, כגון פגיעה המוחית טראומטי (TBI) או דמנציה, במיוחד במחקרים פרה-קליניים. עם זאת, בעלי חיים שונים באופן משמעותי מבני אדם הן באנטומיה של מערכת העצבים המרכזית, כמו גם בתפקוד, ביטוי גנים וחילוף חומרים 2-4. מצד השני, תרבויות 2D במבחנה הן השיטה הנפוצה לחקור ביולוגיה של תא ומשמשות באופן שגרתי לגילוי סמים. עם זאת, בתרביות תאי 2D חסרות מורכבות ורלוונטיות פיסיולוגיים לעומת המוח האנושי 5-7. אמנם אין תחליף לעלות הנמוכה ופשטות של לימודי תרבות תא 2D או המורכבות הניתנות על ידי מודלים של בעלי חיים, הנדסת רקמות 3D יכולה ליצור מודלים מחקר משופרים כדי לסגור את הפער שקיים בין 2D במבחנה ובגישות vivo. הנדסת רקמות 3D מספקת תנאי ניסוי יותר מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיים שהושגו על ידי אינטראקציות תא-תא 3D ורמזים תאיים הניתנים על ידי הפיגומים ביולוגי. DespITE הראיות משמעותיות מאחורי הערך של תרבויות 3D, יש כיום רק כמה מודלים 3D במערכת העצבים המרכזית רקמות כגון תרבויות מקורן בתאי גזע organoid 8-10, neurospheroids 11 ופזרו תרבויות הידרוג'ל 12,13. שיטות טכניות מתקדמות, כולל ליתוגרפיה הרבה השכבתית 14, והדפסת 3D 15 כבר נוצלו ללימוד ריאות, כבד, ורקמת כליה. עם זאת, יש חוסר של מודלים 3D של מערכת העצבים המרכזית, המאפשרים לצמיחה עצבית ממודרת, כגון מחקה את האדריכלות וביולוגיה בקליפת המוח. צמיחה של מופרד neurites מגופי תא עצביים כבר הוכיחה בעבר בתרבויות 2D באמצעות microfabrication 16,17 מאפשר המחקר של מעקב מערכת האקסון, זרימת סידן, ארכיטקטורת רשת ופעילויות. רעיון זה נתן לנו השראה לפיתוח רקמה עצבית מקוטבת 3D שבו גופי תא ושטחי axonal נמצאים בתאים שונים מחקה את הארכיטקטורה שכבתית של המוח 18 </sup>. הגישה שלנו מבוססת על השימוש בעיצוב פיגום משי ייחודי אשר מאכלס בצפיפות גבוהה של תאים בנפח מוגבל ומאפשר תולדה של רשת axonal הצפופה לג'ל קולגן. כאן אנו מדגימים את הליך הרכבה המלא של רקמות כמו מוח כוללים ייצור הפיגום והתרבות עצבית.

Protocol

פרוטוקול בידוד רקמת המוח אושר על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית אוניברסיטת טאפטס הטיפול ושימוש ועומד במכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת השימוש B2011-45). 1. משי פיגום הכנה הכנת פתרון משי מפקעות טוואי משי כפי שתוארה לעיל 19,20. חותך כל גולם לתוך 8 חתיכות שווים באמצעות מספריים. השתמש בכ -11 פקעות ל5 גרם של פקעות מקוטעות. (15 דקות) הכן 2 ליטר של 0.02 M Na 2 CO 3 פתרון ולהביא אותו לרתיחה תוך שימוש בצלחת חמה. (15 דקות) שוקל 5 גרם של פקעות מקוטעות ולהרתיח אותם בNa 2 CO 3 פתרון למשך 30 דקות. מערבבים את המשי הרותח כל כמה דקות עם מרית. צעד זה, הנקרא גם דה-קאמינג, מטהר fibroin משי מחלבונים, sericins הידרופילי. (30 דקות) <li> סחטו את fibroin ביד ולשטוף אותו במים מזוקקים לפחות שלוש פעמים כדי לשטוף את כל sericin וכימיקלים שנותר. (5 דקות) מניחים את fibroin הרטוב בצלחת פטרי ולייבש את תמצית fibroin בO זרימת מכסה המנוע / N. למחרת לשקול את מסת fibroin היבשה ומניח fibroin בכוס זכוכית. (15 דקות) על מנת לפזר את fibroin בפתרון 9.3 M LiBr, לחשב את הנפח הנדרש (במ"ל) של LiBr על ידי הכפלת המסה של fibroin היבש על ידי 4. יוצקים לאט פתרון LiBr על fibroin המשי ולטבול את כל סיבי fibroin באמצעות מרית. מכסה את הכוס כדי למנוע אידוי ומניח אותו על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לסיבים לפזר. (15 דקות) שימוש במזרק, לאסוף את פתרון fibroin מהכוס ולטעון אותו לתוך קלטות הדיאליזה MWCO 3500. לבצע דיאליזה נגד מים מזוקקים למשך 48 שעות. להחליף את המים כל כמה שעות. שימוש במזרק, לאסוף את פתרון fibroin מהקלטות לצינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי פעמיים ב9,000 סל"ד (~ 12,700 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. יוצקים את supernatant לתוך צינור טרי אחרי כל צעד צנטריפוגה וזורקים את הכדור. (40 דקות) למדוד את הריכוז של fibroin ידי אומדן המשקל היבש. יוצקים 1 מיליליטר של תמיסת משי לתוך סירה לשקול. ייבש את המדגם בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לשקול את fibroin המשי היבש ולחשב את הריכוז של פתרון fibroin משי על ידי הכפלת המשקל שהושג על ידי 100. הריכוז הצפוי של פתרון משי הוא 6-9% (w / v). התאם את ריכוז המשי עד 6% (w / v) על ידי דילולו במים מזוקקים. נקודת עצירה: fibroin המשי הנוזלי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש בכלי סגור. הכנת פיגומים נקבוביים מפתרון משי. מסננת NaCl גרגירים להפריד את הגרגרים בגודל 500-600 מיקרומטר, אשר ישמש בשלבים מאוחר יותר. מחק את גרגירשל הגודל להלן 500 מיקרומטר ומעל 600 מיקרומטר. (15 דקות) יוצקים 30 מיליליטר של 6% פתרון משי לתוך תבנית polytetrafluoroethylene (PTFE) (איור 1). בעדינות לפזר 60 גרם של NaCl הסתנן על המשי. הקש המכל להשיג שכבה אחידה של מלח. דגירה 48 שעות ב RT לפלמר המשי. מניחים את תבנית PTFE המכיל פיגום בתנור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לסיים את פילמור ולהתאדות כל נוזל שנותר. הנח את התוכן של עובש PTFE בכוס המכילה 2 ליטר של מים מזוקקים למשך 48 שעות לסנן את המלח. להחליף את המים 2-3 פעמים ביום. הסר את פיגומי ספוג מהתבניות כאשר מלח דלף החוצה לחלוטין עצירת נקודה:. ניתן לאחסן ספוגים שקועים במים ב 4 מעלות צלזיוס במכל סגור כדי למנוע את הפיגומים מהתייבשות. כאשר מוכן, לחתוך את הפיגומים עם ביופסית קוטר 5 מ"מ. לחתוך מראש הפיגומים להגיע לכ 2 מ"מ הגובה. פוNCH ​​את מרכז הפיגום עם אגרוף 2 מ"מ ביופסית קוטר (איור 2 א). (1 שעה) החיטוי הפיגומים שקועים במים לעקרם (מחזור רטוב, 121 ° C, 20 דקות) עצירת נקודה:. ניתן לאחסן ספוגים שקועים במים ב 4 מעלות צלזיוס במכל סגור כדי למנוע את הפיגומים מהתייבשות. לפני זריעת התאים המתוכננת, לטבול את הפיגומים ב0.1 מ"ג פתרון סטרילי / פולי-D ליזין מיליליטר (PDL). דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. שטוף את הפיגומים 3x עם מי מלח פוספט (PBS) כדי להסיר PDL-מחויב שאינו. (30 דקות) 2. בידוד של עכברוש נוירונים קליפתיים לנתח הקורטקס מיום עוברי 18 חולדות (E18) Sprague-Dawley כפי שתואר בעבר על ידי פצ'יפיצ'י ו -27 Peruzzi לאחר פרוטוקול בעלי חיים אושר מתקבל. (2 שעות) דגירה 10 הקורטקס ב 5 מיליליטר של טריפסין 0.25% עם DNase 0.3% אני (מלבלב שור) במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להשבית טריפסין ידי הוספת נפח שווה 1 מ"ג / מיליליטר של חלבון סויה. Triturate הקורטקס באמצעות 10 מיליליטר פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 פעמים עד השעיה תא בודדה נוצרה. להיות עדין ולמנוע היווצרות בועת אוויר. (10 דקות) צנטריפוגה ההשעיה התא ב 127 XG במשך 5 דקות. (בינוני Neurobasal, תוסף B27 1x, 1x Glutamax, 1% פניצילין / סטרפטומיצין). מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום התרבות ספירת התאים. ריכוז התא הצפוי הוא כ 2×10 7 מיליליטר /. (20 דקות) 3. לבנות הרכבה ותרבות זריעת פיגום עם תאים. הזז את הפיגומים סטריליים וכל כלים הנדרשים בתוך ברדס תרבית תאים. מלקחיים סטריליות שימוש למקם את הפיגומים בצלחת תרבית תאי 96-גם הקצאת פיגום אחד בכל טוב. (10 דקות) לטבול את הפיגומים במדיום תרבית תאים לאזן אותם לפני תא זרעING. דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. (10 דקות) לשאוב את עודף הבינוני מהפיגומים. החל מהשעית התא / פיגום 100 μl. (10 דקות) דגירה התאים ב 37 מעלות CO / N כדי לאפשר מצורף תא לפיגום. למחרת בבוקר לשאוב התאים מצורפים שאינו ולהחיל 200 μl / טוב של מדיום תרבות טרי. (10 דקות) פיגום הטבעה עם מטריצת קולגן. (2 שעות) הנח 10x PBS, מים, 1 N NaOH ועכברוש זנב אני קולגן על קרח. הכן פתרון עבודה של קולגן לפי הוראות היצרן. לשמור על קרח עד בונה-זרע התא מוכנה (עד שעה 1). הסר את מבני משי תא-זרע מהחממה ולשאוב את עודף בינוני. מלקחיים סטריליות באמצעות העברת הפיגומים לבארות הריקות על הצלחת היטב ולטבול כל פיגום בשל 3 מ"ג / מיליליטר פתרון קולגן 100 μl. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחזרהבחממה במשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של קולגן. החל מתרבית תאים בינונית מחוממת מראש 100 μl / טוב. תרבות בונה במשך שבוע אחד לשנות את המדיום בכל יום על ידי החלפה רק חצי הנפח של המדיום. 4. מיקרוסקופית ניתוח צביעה חי / מת (1 שעה) הכן פתרון מניות של יודיד propidium (PI) 1 מ"ג / מיליליטר (1.5 מ"מ) במים מזוקקים. הכן פתרון מניות של diacetate והעמסת (FDA) 2 מ"ג / מיליליטר באצטון. הכן פתרון עובד המכיל 10 מיקרומטר PI ו0.15 מיקרומטר FDA מדולל PBS. טרום חם הפתרון ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם להסיר את esterases הסרום. לשאוב את PBS. ליישם את הפתרון עובד מראש חימם על התאים למשך 2 דקות ולשטוף אותו עם PBS. השתמשו במיקרוסקופ epifluorescent לתמונת התאים (לשעבר PI λ = 490 ננומטר, λ = 570 ננומטר; ה- FDA לשעבר λ = 490 nמ ', אותם λ = 514 ננומטר). הכתם נשאר יציב לאורך 40 דקות. צביעה ממושכת עלולה לגרום להכתמה נוקבים כתוצאה מספיגת PI על ידי התאים ושיתוף הלוקליזציה של PI / FDA בתאים. Immunostaining בנקודת הזמן הרצויה של התרבות לתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות ב RT. בשל הרעילות של PFA רותח צעד התיקון צריכה להתבצע במנדף הכימי. לשטוף פיגומים עם 3x PBS נקודת עצירה:. ניתן לאחסן מבנים קבועים PFA PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני שתמשיכו עם צעדים נוספים. דגירה הפיגומים ב0.2% טריטון, 0.25% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS המכילים O נוגדן ראשוני / N ב 4 ° C. למחרת לבטל את הפתרון מכתים ולשטוף את הפיגומים 3 x 30 דקות עם PBS להסיר הנוגדן מאוגד העיקרי. דגירה הדגימות עם נוגדנים משני בדילול מלא 0.2% טריטון, BSA 0.25% ב PBS עבור 2שעות ב RT. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את הפיגומים 3 x 30 דקות עם PBS להסיר נוגדנים משני מאוגד. תמונת הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 20X על ידי לקיחת 100 מיקרומטר Z-סעיפים של המדגם עם שלב 1 מיקרומטר. כדי להמחיש את neurites דקה רזולוציית התמונה צריכה להיות של 1,024 x 1,024 פיקסלים מינימום. RNA, DNA ובידוד חלבון הערה: RNA, DNA ובידוד חלבון מתבצע באמצעות ערכת מיני AllPrep DNA / RNA / חלבון מסחרי בהתאם להוראות היצרן. מלקחיים סטריליות באמצעות העברת הפיגומים מצלחת התרבות לצינור סטרילי 2 מיליליטר. הנח פיגום אחד לכל צינור. הוסף 200 μl של חיץ RLT על צינור אחד. לשבש את המבנה על ידי פיצולו עם microscissors סטרילי. לhomogenize הרקמה שיבש, להעביר את התוכן של הצינור לעמודת הספין. ספין 2 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge.Lysate הוא הומוגני כשהוא עובר דרך טור הספין. לאסוף את הזרימה דרך ולהשתמש בו באופן מיידי כדי לבודד RNA, DNA וחלבונים הבאים הפרוטוקול של היצרן. לכמת את התשואה של חומצות גרעין בכל שיטה תואמת אחרת (לדוגמא, NanoDrop). לכמת את תשואת החלבון באמצעות assay חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. למדוד את התוצאה של assay באמצעות microplate קורא באורך גל 562 nm. הערה: התשואה הצפויה של חומצות וחלבון למבנה ביחס לצפיפות תאי גרעין מוצגת באיור 4.

Representative Results

חתוכי ספוגים משי מוצקים לצורת הסופגנייה מייצג רעיון ייחודי ופשוט להשגת ארכיטקטורה ממודרת דומות רקמה (איור 2 א) העצביים. המבנה הנקבובי ביותר של הפיגום עם הגודל הנקבובית של כ -500 מיקרומטר תוצאות בשטח גבוה במיוחד ומאפשרות זריעה וצמיחה של צפיפות גבוהות תאים בתוך נפח קטן (2×10 7 / מיליליטר) (איור 2). בנוסף, הנקבוביות הגבוהה של הפיגום מאפשר דיפוזיה בלתי מוגבלת של חומרים מזינים ופסולת וכתוצאה מכך כדאיות מעולה של תרביות תאים צפופות על מסגרות זמן ממושכות. על זריעת תאי העצב במהירות אחידה ולצרף אל פני השטח של נקבוביות הפיגום. לאחר מצורף תא שלם ותאי equilibrated על מצע המשי, פיגום ספוג מלא במטריצת קולגן הרכה על מנת לספק סביבת 3D להיווצרות רשת axonal (איור 3 </strong>). בהעדר מטריצת קולגן המידור של אקסונים וגופי תא אינו אפשרי כתאי עצב לגדול הרחבות רק על פני השטח של הנקבוביות וכתוצאה מכך מעורבות רשתות כפי שנמצא עם משטחי 2D (איור 3). לעומת זאת, ג'ל קולגן מספק meshwork התומך בתוצאת axonal נרחבת ב3D, בעוד גופי תא עצביים נשארים צמודים לפיגום המשי (איור 3 ג). דפוס צמיחה זה מוביל למידור של גופי תא ורשתות axonal טהורים (איור 3D), שדומה לחומר האפור ולבן של קליפת המוח במוח. מלבד מיקרוסקופיה, ניתן להעריך את המבנים עם מגוון רחב של שיטות אחרות 18, בהתאם לשאלה מאחורי הניסוי. לדוגמא, הבידוד של DNA, RNA וחלבון מהבונה יכול להיות בקלות בוצע באמצעות ערכות מסחריות (איור 4). התשואה של חומצות גרעין והחלבונים PEמבנה r תלוי במספר תאי זרע בתחילה על פיגומי משי. יותר תאי זרע גבוה יותר התשואה של ה- DNA, RNA וחלבון. עובש איור 1. PTFE משמש להכנת פיגום ספוגי משי הממדים:.. 10 סנטימטרים קוטר, 2 סנטימטרים גובה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. מודל 3D רקמות כמו מוח. () פיגום ספוגי משי נקבובי. הכתמה (ב) בשידור חי / המתה של תאי עצב ביום 1 על זריעה על פיגום משי לפני קולגן הטבעה (תאים ירוקים-חיים, תאים אדומים-מתים). פנלים בצד ימין מראים magnification של האזור שנתפס במסגרות אדומות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. עצבי תולדה ממודרת במודל הרקמות כמו המוח-3D () תאי פיגום:. תא גוף אדום-תא, תא הכחול-axonal. דפוס צמיחה עצבי ביום 1 על זריעה לפני הטבעת קולגן (ב '). (ג). תולדה עצבית ביום 7 על זריעה בתא גוף תא. תולדה עצבית ביום 7 על זריעה בתא axonal (ד '). ירוק -. ΒIIITubulin אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זהדמות. תשואת איור 4. צפוי של RNA () ו- DNA, וחלבון (ב) למבנה ביחס לכמות תאי זרע לפיגום (± סטיית תקן, n = 5). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

Discussion

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.

The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.

The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.

As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.

Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

Materials

Na2CO3 Sigma-Aldrich 223530 –
LiBr Sigma-Aldrich 213225 –
MWCO 3500 dialysis cassettes  Thermo Fisher 66110 –
Heating plate Fisher Scientific Isotemp –
Centrifuge 5804 R Eppendorf – –
Sieve Fisher Scientific – No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold – – made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl Sigma-Aldrich 71382 –
Biopsy Punch 5mm World Precision Instrument 501909 –
Biopsy Punch 2mm World Precision Instrument 501908 –
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5MG final concentration 10 ug/ml, dissolved in water
PBS Sigma-Aldrich D1283-500ML –
Trypsin Sigma-Aldrich T4049-500ML –
DNase Roche 10104159001 final concentration 0.3%
Soybean protein Sigma-Aldrich T6522-100MG final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 warm up to 37°C before use
B27 supplement 50x Gibco 17504-044 –
Glutamax Gibco 35050-061 –
Penicilin Streptomycin Corning 30-002-CI –
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 final concentration 3 mg/ml
NaOH Sigma-Aldrich S2770 corrosive
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170-10MG toxic
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378-5G –
Olympus MVX10 Olympus – –
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G –
anti-βIIITubulin antibody  Sigma-Aldrich T2200 rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546 Molecular Probes A11010 goat 1:250
goat serum Sigma-Aldrich G9023-5ML –
Leica SP2 confocal microscope Leica – objective 20x
QIAshredder Qiagen 79654 –
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit Qiagen 80004 –
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023  –
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific – –
BCA protein assay Thermo Scientific 23225 –
Plate reader Spectramax M2 Molecular Devices – absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type TedPella 1346 –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, S4 (2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965 (2012).

Tags

Silk-collagenPolarized NeuronsBrain-derived NeuronsNeural NetworkAxonal GuidanceCell-cell InteractionCell-matrix InteractionElectrical Function

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W. L., White, J. D., Tang-Schomer, M., Kaplan, D. L. Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue. J. Vis. Exp. (104), e52970, doi:10.3791/52970 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image