Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em> Salmonella</em> Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Les bactéries pathogènes intracellulaires se répliquent soit directement dans le cytosol de la cellule hôte, ou dans des compartiments spécialisés vacuolaires ^1. Durant la phase initiale de l'infection la plupart des pathogènes se internalisés soit par phagocytose par des cellules spécialisées (telles que les macrophages) ou par la promotion active de leur propre absorption dans des cellules non-phagocytaires. Dans les cellules phagocytaires, le phagosome fusionne généralement avec les lysosomes pour former un compartiment de dégradation, où les particules phagocytées sont digérés. Cytosoliques bactéries spécialisées, telles que Francisella novicida ou Shigella flexneri, échapper à la dégradation du phagosome en induisant la rupture du phagosome et d'échapper par la suite dans le cytosol ^2,3. Cela nécessite mécanisme de virulence associés tels que l'île Francisella pathogénicité (FPI) ou Shigella flexneri SST3, qui injecte des protéines effectrices qui favorisent vacuolaire rupture ^2-4. Les caractéristiques de cytosol de la cellule hôteun certain nombre de récepteurs conservés de reconnaissance des formes qui reconnaissent normalement la présence de pathogènes et induisent immunitaire inné signalisation ^5. En outre, xenophagy, une forme anti-microbienne de l'autophagie peut dégrader les bactéries qui pénètrent dans le cytosol. Cytosoliques bactéries sont normalement bien adaptés à émousser ou de contourner ces réponses en utilisant différentes stratégies. Par exemple, Francisella modifie ses LPS pour éviter la reconnaissance de l'hôte et Shigella empêche le recrutement de l'autophagie en utilisant des protéines effectrices sécrétées ^6,7.

Une autre stratégie pour échapper à la dégradation lysosomale est employé par le modèle vacuolaire pathogène Salmonella enterica sérotype Typhimurium, par la suite dénommée Salmonella typhimurium. Salmonella utilise un SST3 d'injecter effecteurs qui remodèlent le phagosome initiale dans sa niche intracellulaire, la Salmonella contenant vacuole (SCV) ^8,9. La manipulation continue des voies d'accueil estnécessaire pour maintenir cette vacuole en recrutant des lipides et autres nutriments vers la vacuole. En effet, un mutant de Salmonella SIFA ne parvient pas à maintenir la stabilité vacuolaire, et pénètre dans le cytosol des cellules hôtes en quelques heures après l'infection, ce qui conduit à l'activation des voies immunitaires innées et le recrutement de autophagie ^8. Évasion Vacuolar de Salmonella varie en fonction du type de cellule qui est des études, et plusieurs rapports ont montré que dans les cellules épithéliales même WT Salmonella peut échapper à la SCV et hyperreplicate dans le cytosol ^10. Des rapports récents montrent que la détection immunitaire innée des pathogènes vacuolaires dépend aussi de la capacité de l'hôte à reconnaître et à déstabiliser vacuoles contenant pathogènes (PCV) ^11-14.

Étant donné que l'hôte ou des bactéries génotype peuvent affecter la distribution des bactéries intracellulaires entre le vacuolaire et le compartiment cytosolique, il est nécessaire de quantifier le nombre de vacuolaire vs.bactéries cytosoliques. Etant donné que, dans la plupart des configurations expérimentales cellules hôtes sont infectées avec plus d'une bactérie, et par la suite peuvent abriter plusieurs bactéries dans différents compartiments sous-cellulaires, une technique est nécessaire qui permet la quantification de la teneur en bactéries simples. Perméabilisation sélective (également connu sous le nom d'essai de protection phagosome) fournit cette résolution ^2,4,10,12. Le dosage est basé sur la perméabilisation sélective de la membrane plasmique de la cellule hôte avec le détergent digitonine, ce qui laisse les membranes vacuolaires intact et permet ainsi la coloration sélective de bactéries avec des anticorps cytosoliques. Ici, nous fournissons deux protocoles de quantification des cytosolique et vacuolaire Salmonella typhimurium en utilisant perméabilisation différentiel. Le principe de cette méthode est décrite dans la figure 1: les macrophages de moelle osseuse dérivés (BMDMs) sont infectées avec phase stationnaire mCherry exprimant Salmonella. Phase stationnaire Salmonella besoin to être utilisés car ils régulent à la baisse l'expression de la SPI-1 SST3, dont l'activité serait autrement reconnu par l'inflammasome NLRC4 et induire la mort cellulaire rapide (pyroptosis) de la BMDMs ^15. Suite à l'infection des cellules sont lavées et traitées avec 50 pg / ml de digitonine pendant 1 minute. Les cellules sont lavées de nouveau et immédiatement incubées avec des anticorps anti-Salmonella couplés au FITC pour marquer des bactéries avec accès au cytosol. Après un lavage supplémentaire cellules sont lysées de pas et le pourcentage de mCherry + (vacuolaire) et FITC + / + mCherry (cytosolique) de bactéries est déterminée par FACS. Nous présentons également une adaptation de ce procédé qui peut être utilisé en l'absence de souches exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles (Figure 2). Des étapes supplémentaires sont introduites après l'étiquetage FITC dans lequel les cellules sont fixées et complètement perméabilisées. Par la suite, toutes les bactéries sont colorées avec des anticorps anti-Salmonella et des anticorps secondaires correspondantes. Detection se fait alors par microscopie à la place de l'analyse FACS.