כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em> סלמונלה</em> ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

חיידקים פתוגנים תאיים לשכפל באופן ישיר בcytosol התא המארח, או בתאי vacuolar מיוחדים ^1. בשלב הראשוני של הזיהום ביותר פתוגנים לקבל הפנימו או על ידי phagocytosis על ידי תאים מיוחדים (כגון מקרופאגים) או על ידי פעיל בקידום הספיגה שלהם לתאים שאינם phagocytic. בתאי phagocytic, phagosome בדרך כלל משלב עם lysosomes כדי ליצור תא נגרע, שבו חלקיקי phagocytosed מתעכלים. חיידקי cytosolic מיוחדים, כגון Francisella novicida או Shigella flexneri, לברוח השפלה phagosomal ידי גרימת הקרע של phagosome ולאחר מכן לברוח ^ל2,3 cytosol. זה דורש מנגנון הקשורים ארסי כגון פתוגניות אי Francisella (FPI) או Shigella flexneri T3SS, שמזריק חלבוני מפעיל המקדמים קרע vacuolar ^2-4. תכונות cytosol התא המארחמספר הקולטנים זיהוי תבניות נשמרים, כי בדרך כלל לזהות את הנוכחות של פתוגנים ולגרום לחיסון מולדים איתות ^5. בנוסף, xenophagy, צורה אנטי-מיקרוביאלי של autophagy יכולה לבזות חיידקים שנכנסים cytosol. חיידקי cytosolic בדרך כלל גם מותאמים ללהקהות או לעקוף תגובות אלה באמצעות אסטרטגיות שונות. לדוגמא, Francisella משנה LPS כדי להימנע מהכרת המארח וShigella מונע גיוס autophagy באמצעות חלבונים מופרשים מפעיל ^6,7.

אסטרטגיה נוספת לברוח השפלה lysosomal מועסקת על ידי Typhimurium serovar enterica הפתוגן vacuolar המודל סלמונלה, התייחס לאחר מכן כלtyphimurium סלמונלה. סלמונלה משתמשת T3SS להזריק effectors שלשפץ phagosome הראשוני לנישה תאית שלה, סלמונלה המכיל vacuole (SCV) ^8,9. מניפולציה מתמשכת של מסלולי מארח היאנחוץ כדי לשמור על vacuole זאת על ידי גיוס שומנים וחומרים מזינים אחרים לvacuole. ואכן, מוטציה SIFA של סלמונלה לא מצליחה לשמור על יציבות vacuolar, ונכנסה cytosol של תאי מארח בתוך שעות לאחר הדבקה, וכתוצאה מכך ההפעלה של מסלולי חיסון מולדים וגיוס autophagy ^8. בריחת vacuolar של סלמונלה משתנה בהתאם לסוג התא שהוא לימודים, וכמה מחקרים הראו כי בתאי אפיתל אפילו WT סלמונלה יכולה לברוח SCV וhyperreplicate בcytosol ^10. הדיווחים אחרונים מראים כי זיהוי חיסון מולדים של פתוגנים vacuolar גם תלוי ביכולת של המארח להכיר ולערער vacuoles המכיל הפתוגן (PCVs) ^11-14.

בהתחשב בכך ששניהם המארח או חיידקי גנוטיפ יכול להשפיע על ההפצה של חיידקים תאיים בין vacuolar ותא cytosolic, יש צורך לכמת את מספר לעומת vacuolarחיידקי cytosolic. מאז, בהגדרות ניסיוניות רוב תאי מארח נגועים בחיידק אחד או יותר, ולאחר מכן יכולים נמל כמה חיידקים בתאי subcellular שונים, יש צורך בטכניקה המאפשרת כימות ברמה של חיידקים בודדים. permeabilization ההפרש (הידוע גם בassay הגנת phagosomal) מספק רזולוציה זו ^2,4,10,12. Assay מבוסס על permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה התא המארח עם digitonin חומר הניקוי, מה שמשאיר את קרומי vacuolar שלמים ובכך מאפשר צביעה סלקטיבית של חיידקי cytosolic עם נוגדנים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים לכימות של cytosolic וvacuolar typhimurium סלמונלה באמצעות permeabilization ההפרש. העיקרון של שיטה זו מתואר באיור 1: מקרופאגים מח העצם נגזרים (BMDMs) נגועים בשלב נייח mCherry להביע סלמונלה. השלב נייח סלמונלה צריכה to לשמש כי הם downregulate הביטוי של T3SS SPI-1, שפעילותם אמורה היה להיות מוכרת על ידי inflammasome NLRC4 ולגרום למוות מהיר של תאים (pyroptosis) של ¹⁵ BMDMs. בעקבות זיהום תאים נשטפים וטופלו עם 50 / מיליליטר מיקרוגרם של digitonin דקה 1. תאים נשטפים שוב מייד וטופחו עם נוגדנים נגד סלמונלה מצמידים את FITC לסמן חיידקים עם גישה לcytosol. לאחר שטיפה נוספת תאי צעד הם lysed ואחוז mCherry + (vacuolar) וFITC + / mCherry + (cytosolic) החיידקים נקבע על ידי FACS. כמו כן, אנו מדווחים על הסתגלות של שיטה זו, שניתן להשתמש אם אין זנים להביע חלבון פלואורסצנטי זמינים (איור 2). צעדים נוספים שהוכנסו לאחר תיוג FITC שבו תאים הם קבועים וpermeabilized לחלוטין. לאחר מכן כל חיידקי מגואלות נוגדנים נגד סלמונלה ונוגדנים משני המתאימים. Detשיקוף מכן על ידי מיקרוסקופ במקום ניתוח FACS.