ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

このプロトコールに記載ゼブラフィッシュの胚を操作するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.リンゲル溶液の調製任意の塩の析出を回避するために、継続的な攪拌を介して超純H 2 Oで116のNaCl、2.9のKCl、3.6 mMのCaCl 2を 、および5mMのHepesの溶液を作ります。 塩を添加し、溶液が依然として撹拌している間した後、100単位/ mLのあたりペニシリンおよび1mlあたり100μgのストレプトマイシンを追加します。 すべての抗生物質との塩を添加した後、滅菌容器内の溶液と店舗のろ過滅菌を行います。 注：N-フェニルチオ尿素（1-フェニル-2-チオ尿素）またはPTUは、胚の健康への悪影響なしにビーズ移植胚における色素の形成を阻止するためにリンゲル液に添加することができます。リンガー/色素ブロッキング溶液を調製し、concenを使用0.003％PTUのtration。原因追加するPTUの低濃度にはPTU粉末の微小量を加えることを避けるために、少なくとも1 L、リンゲル液の大容量がなされることをお勧めします。溶液は攪拌されながら、ステップ1.2の間にPTUを追加します。 2.トリカイン溶液の調製 9.5のpHにバランスのとれた、超純H 2 Oで作られた1 Mストックから、溶液1L当たり3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）の2グラムを加えた0.1Mトリスを追加注：トリカインビーズ注入表現型をアッセイするために、所望の時点でのゼブラフィッシュ胚を安楽死させるために使用されます。 3. E3溶液の調製 E3の1 Lを作成するために、0.25MのNaCl、10mMの塩化カリウム、12.5ミリモルのCaCl 2、および16.6 mMの硫酸マグネシウムの超純水L 1の溶液を作ります。 真菌の増殖を阻害するためにE3溶液にメチレンブルーの200μlを添加します。 マイクロビーズの転送のために針を引っ張る4 1.0ミリメートル、ID：0.5ミリメートル、長さ10cmでのODでフィラメントと火災研磨ホウケイ酸ガラスを使用してください。 細い針を準備するためにマイクロピペットプラーにborosilicatedガラスを置きます。 注：= 245、速度= 200、および時間= 125を引き出し、ヒート= 540：次の4つの寸法は、針を引っ張るための出発点として使用することができます。 使用するまで、針の先端を壊す防止するために、粘土や粘着テープのストリップに位置し、針の適切な数、カバーされたプラスチック製のペトリ皿中の店を、引っ張りました。 希望ボアサイズに針の先端をトリミングするには、針の端部を獲得するために微細な鉗子のペアを使用しています。 注意：針の穴の大きさは、利用されているマイクロビーズの大きさだけでなく、ユーザーの取り扱いの好みに応じて異なります。 50〜100μmでの範囲のマイクロビーズを利用する場合は良い出発点は、100〜200μmの範囲でクラフトボアサイズにあります。 プリオ完成したマイクロビーズの転送装置を形作るために毛細管ホルダーにトリミングされた針を挿入し、使用するには、r。 5.ウィスカ/ラッシュツールの準備ウィスカー、ラッシュ、または天然または人工毛フィラメントの他の小さなまだしっかり作品を入手します。 45°の角度で、フィラメントのベースの近くにカットします。恒久的に透明な接着剤の接着剤を使用して、P-1000マイクロピペットの先端にウィスカを接着。 6.マイクロビーズ移植トレイの準備 E3溶液100mlを2％E3アガロースゲルを作るためにアガロースを2gを混ぜます。 以上バブリングからゲルを回避するために、フラスコを30秒ごとに旋回250mlの三角フラスコに1分30秒間、2％アガロース溶液を加熱します。 60ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿の蓋を取り、上向きに内部と大きく150ミリメートル×15 mmディッシュに入れてください。 ダウンアンカーに確認しながら、150ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿に熱いアガロースゲルを注ぎます人差し指で小さい皿の蓋。 注：アガロースゲルを注ぐときに形成することになる結露を除去するために小さい皿の蓋以下の薄層を許可します。これは、解剖顕微鏡下で見てビーズが容易になります。 アガロースが冷却されると、それが固化する前に、ゲルのウェル金型を配置します。これは、胚の容易な配置を可能にします。 注：それはゲルの上に浮遊するまで、ウェル内の気泡を回避するために、角度でゆっくりと金型を配置します。 ゲルが固化した後にミクロを使用して、慎重に井戸型を削除します。 4℃でE3のソリューションとストアを追加します。 7.胚コレクションシステム水でそれらを充填し、その後チャンバーO / Nで大人のゼブラフィッシュの雄（複数可）とメス（S）のペアを配置することにより、分周器によって分離された嵌合室を準備します。 細かい金網ストレーナーを使用して受精卵を収集し（胚のステージは若干異なります）。 そこに皿の中のE3溶液約25ミリリットルをストレーナーに残された卵がなくなるまで逆さまにストレーナを回すとE3の細い流れでそれをすすぐことによって、クリーン、直径10cmシャーレに受精卵を堆積し、。 収集後、クラッチ内の発達非同期につながり、困難な所望の時間点を収集するかもしれない過密を回避するために、いくつかの皿（皿当たり約50〜60の卵）に卵を割ります。 標準的なゼブラフィッシュステージングシリーズ40に従って発達評価を可能にするために28.5℃のE3溶液中で胚をインキュベートします。 注：胚は、古い段階での操作は、光学的透明度を必要とする場合は、顔料の開発を防ぐために、24時間後に受精（HPF）でE3 / PTUに転送する必要があります。 8.ビーズ移植所望の試験分子濃度のマイクロビーズまたは対応する車両のインキュベート適切な量​​で必要な時間のためのolution。 注：研究者は、溶液内のマイクロビーズの可視化を可能にするどちらの無菌直径3〜6センチメートル範囲のペトリ皿、またはマルチウェルプレートを使用することができます。時間は、目的の分子の種類や量に応じて変えることができる、と研究者は、インキュベーションの持続時間と、光や温度に対する感度などの他の側面については、メーカーまたは公開勧告を参照してください。 胚は、所望の発達の時点に到達した後、微細な鉗子を使用して、絨毛膜から胚を削除します。 溶液に、それらを順応さ10分間の抗生物質でろ過リンゲル液中の胚を培養します。 胚が順応している間、注入トレイに囲まビーズプレートにビーズを移し、10分間、リンゲル液でそれらを洗浄。 注：この時点に到達した後、50分以内にビーズを埋め込みます。このW病気の一つは目的の分子の小さい濃度のビーズを注入する可能性を減少させます。 マイクロビーズが移植される関心領域がアクセス可能であるように、それらの向きに注意しながらマイクロビーズ注入トレイのウェルに配列胚を、。 タングステン針を使用して胚に小さな切開を行います。 静かにキャピラリカラムにマイクロビーズを引っ張る、ピペットの電球を押下し、目的の宛先にマイクロビーズを転送するために圧力を解放する：マイクロキャピラリートランスファーピペットを用いて、胚にマイクロビーズを転送します。 胚の内部にマイクロビーズを配置するためにウィスカー/ラッシュツールを使用します。注：それが治癒するようにマイクロビーズは、胚から追放されることはありませんので、切開部位から離れた組織へのマイクロビーズを配置するようにしてください。